Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этике животных.
1. Записи патч-зажима
- Поместите раствор электрода (см. таблицу 1) на лед, чтобы предотвратить разрушение. Наполните стеклянную патч-пипетку отфильтрованным внутриклеточным раствором (шприц-фильтр, размер пор: 0,2 мкм) и поместите пипетку в держатель пипетки в головке. Мягко надавите на пипетку через шприц объемом 5 мл, сместив поршень примерно на 1 мл, прежде чем опустить пипетку в раствор для ванны.
Примечание: Это предотвращает блокировку пипетки.
- Выберите режим "V-clamp", повернув ручку режимов на усилителе, затем откройте интерфейс "Проверка мембраны" в программном обеспечении. Переместите пипетку ближе к целевому нейрону под микроскопом.
заметка: В интактном препарате DRG тонкий слой сателлитных глиальных клеток инкапсулирует каждый нейрон.
- Используйте положительное давление пипетки для прохождения по слою сателлитных глиальных клеток до тех пор, пока не будет наблюдаться внезапное увеличение пространства между нейроном и окружающим слоем сателлитных глиальных клеток. Продолжайте двигать пипетку по направлению к нейрону до тех пор, пока на нейроне не появится «ямочка».
заметка: По сравнению с записями от диссоциированных нейронов, положительное давление должно быть немного больше, что поможет проникнуть в слой сателлитных глиальных клеток и увеличит шансы на успешное исправление.
- Уменьшите положительное давление. Затем добейтесь гигаомного уплотнения с мягким всасыванием.
заметка: При использовании этого метода успешность записи составляет не менее 70%.
- Получите конфигурацию записи всей ячейки, как описано ранее.
- Кратковременно проникайте в клеточную мембрану нейрона с помощью короткого, но сильного отсасывания. В качестве альтернативы можно использовать функцию усилителя "zap" во время всасывания.
- После того, как будет установлен режим для всей ячейки, компенсируйте емкость всей ячейки и последовательное сопротивление (Rs), поворачивая ручки компенсации емкости и сопротивления на усилителе.
заметка: Rs обычно составляет 5-20 МОм.
- Откажитесь от ячейки, если Rs изначально больше 30 МОм или изменяется более чем на 20% во время записи. Также измерьте потенциал мембраны покоя; отказаться от ячейки, если ее напряжение превышает -50 мВ.
- Закройте окно "Тест мембраны". Выберите режим "I-clamp normal", повернув ручку режимов на усилителе.
- Нажмите «открыть протокол» в программном обеспечении, выберите и загрузите протокол измерения реобазы. Нажмите «Запись», чтобы начать запись. Измерьте входное сопротивление и реобазу для изучения возбудимости нейронов путем введения градуированной серии деполяризующих токов с шагом 100 пА.
- Нажмите «открыть протокол» в программном обеспечении, выберите и загрузите протокол измерения реобазы. Нажмите «Запись», чтобы начать запись. Измерьте входное сопротивление и реобазу для изучения возбудимости нейронов путем введения градуированной серии деполяризующих токов с шагом 100 пА.
- Используйте программное обеспечение для сбора и анализа данных (например, Clampfit) для анализа записанных следов в соответствии с инструкциями производителя. Программное обеспечение рассчитывает входное сопротивление (Rin) на основе установившегося пространственного соотношения ВАХ при подаче гиперполяризационных токов. Переместите курсор, чтобы измерить значение реооснования и порога мембраны. заметка: Амплитуда тока, необходимая для индукции AP, определяется как реобаза, а наименьшее напряжение для индукции AP определяется как мембранный порог
.
- Запишите индуцированные токи лиганда.
- Наполните пипетку определенными агонистами.
Примечание: В настоящем отчете мы использовали 100 мкМ глутамата и 100 мкМ AITC для индукции токов, опосредованных глутаматными рецепторами и рецепторами TRPA1 соответственно.
- Проверьте пипетку, чтобы убедиться, что внутри нет пузырьков воздуха. Поместите пипетку в держатель пипетки. Подсоедините держатель пипетки к трубке, подключенной к системе дозирования лекарств.
- С помощью манипулятора переместите пипетку в пределах 50 мкм от нейрона. Установите давление в системе дозирования препарата на 1 фунт на квадратный дюйм и продолжительность на 1 секунду. Переключите режим записи на напряжение зажима, а зажим на -70 мВ. Кратковременно подайте давление через систему дозирования лекарств, чтобы зарегистрировать ток, вызванный лекарством.
Таблица 1
Кабель
См.
См.
См.
| 100 мл внутриклеточного раствора |
| Концентрация (мМ) | компонент | Мвт | г |
| 130 | KGluconate | 234.24 | |
| 10 | KCl | 74.55 | |
| 10 | ХЕПЕС | 238.3 | |
| 10 | ЭГТА | | |
| 2 | MgCl2*6H2O | 203.3 | |
| Примечания: Отрегулируйте pH до 7.4 с помощью KOH и осмолярность до 260 - 280 mOsm с помощью сахарозы и дистиллированной воды. Добавьте 2 мМ MgATP, 0,5 мМ Na2GTP и отфильтруйте перед немедленным использованием. |
