Оценка ленточных синапсов в определенных частотных областях улитки мыши

Аннотация

Источник: Yu, S., et al. Морфологическая и функциональная оценка ленточных синапсов в определенных частотных областях улитки мыши. J. vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует метод оценки ленточных синапсов в определенных областях улитки мыши. Он использует методы иммуноокрашивания и конфокальной визуализации для идентификации функциональных синапсов в различных частотных областях в каждом повороте улитки.

Протокол

Все процедуры, связанные с обращением с животными, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Селекция животных

1. Для всех экспериментов в качестве животной модели использовались взрослые самцы мышей C57BL/6J (в возрасте 8 недель).
   Примечание: Мыши C57BL/6J, несущие сплайс-вариант Cdh23, демонстрируют ускоренное старение в слуховой системе, что выражается в потере 40% ленточных синапсов в базальном повороте улитки и 10% потере в среднем повороте к 6-месячному возрасту, за которым следует быстрое увеличение этой потери во всей улитке с возрастом. Таким образом, мы рекомендуем соблюдать осторожность при использовании мышей C57BL/6J старше 6 месяцев для слуховых исследований. В зависимости от конкретных целей эксперимента могут быть использованы и другие линии мышей.
2. Осмотрите мышей с помощью профессионального диагностического карманного отоскопа, чтобы исключить патологии наружного или среднего уха перед оценкой слуха. Потенциальные признаки могут включать жидкость или гной в наружном слуховом проходе, покраснение и отек местных тканей, а также перфорацию барабанной перепонки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это встречается редко, после выявления мышей с заболеваниями наружного или среднего уха следует исключить.

2. Оценка слуха

1. Обезболивайте мышей с помощью внутрибрюшинного введения смеси кетамина гидрохлорида (100 мг/кг) и ксилазина гидрохлорида (10 мг/кг). Оценивайте глубину анестезии с помощью болевых раздражителей (например, рефлекса защемления пальцев ног).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда рефлекс щипкового пальца ног полностью отсутствует, животное достигло достаточной глубины анестезии для слухового тестирования. Если требуется больше времени для записи двусторонней ABR (слуховой реакции ствола мозга), введите меньшую дозу (одну пятую от первоначальной дозы) анестетиков для восстановления исходной анестезиологической плоскости. Следите за тем, чтобы не допустить передозировки анестетика, так как это может привести к смерти мышей.
2. Поддерживайте температуру тела животного, находящегося под наркозом, на уровне 37,5 °C с помощью терморегулирующей грелки. Поместите животное под наркозом в помещение с электрическим и акустическим экраном, чтобы избежать помех во время проверки слуха.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте физиологическую температуру в течение всей процедуры до тех пор, пока животное полностью не придет в себя, чтобы предотвратить смерть, вызванную гипотермией после анестезии.
3. Подкожные игольчатые электроды (20 мм, 28 G) размещаются в верхней части черепа (регистрирующий электрод), в ипсилатеральной околоушной области ниже ушной раковины измеряемого уха (референтный электрод) и в контралатеральной околоушной области (заземляющий электрод), на глубине 3 мм под кожей головы мыши соответственно.
4. Используйте динамик с закрытым полем для акустической стимуляции с помощью пластиковой трубки диаметром 2 см с конусообразным наконечником. Вставьте наконечник в наружный слуховой проход.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что электрическое сопротивление записывающего электрода и электрода сравнения составляет менее 3 кОм (обычно 1 кОм). Если импеданс высокий, измените место вставки электрода, очистите электрод спиртом или замените электрод, чтобы избежать изменения амплитуды волны ABR.
5. Для записи ABR генерируются тональные пипы (длительность 3 мс, время нарастания/спада 1 мс, скорость 21,1/с, частота: 4–48 кГц) и представление их с убывающими уровнями звукового давления (SPL) от 90 до 10 дБ с шагом 5\u201210 дБ SPL. На этом этапе отклики усиливаются (в 10 000 раз), фильтруются (0,1–3 кГц) и усредняются (1 024 выборки/уровень стимула).
   ПРИМЕЧАНИЕ: ABR собираются для каждого уровня стимула с шагом 10 дБ, с дополнительными 5 шагами дБ вблизи порога.
6. На каждой частоте определите порог ABR, который относится к минимальному уровню звукового давления, что приводит к надежной записи ABR с одной или несколькими различимыми волнами, которые могут быть четко идентифицированы при визуальном осмотре><. ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно необходимо повторить процесс для низких уровней звукового давления около порога, чтобы обеспечить согласованность осциллограмм. Порог отклика – это самый низкий уровень стимула, при котором можно наблюдать сигнал, когда снижение на 5 дБ привело бы к исчезновению сигнала.

3. Обработка кохлеарной ткани

1. После записи ABR усыпьте мышей, находящихся под наркозом, через шейный вывих, обезглавьте их, обнажите буллу с вентральной стороны и вскройте их острыми ножницами, чтобы получить доступ к улитке.
2. С помощью тонких щипцов удалите височные кости, перережьте артерию стремени, удалите стремечко из овального окна и разорвите круглую оконную мембрану. Сделайте небольшое отверстие на вершине улитки, осторожно вращая кончик иглы (13 мм, 27 G).
3. Зафиксировать выделенные кости с помощью 4% (масс./об.) параформальдегида в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4) на ночь при температуре 4 °C. С помощью пипетки с тонким наконечником аккуратно промывайте фиксатор через перилимфатические пространства путем нанесения на овальные или круглые окна (в качестве входа) и отверстие на вершине (в качестве выхода).
   Примечание: Некоторые белки требуют короткой продолжительности фиксации, чтобы избежать разрушения их эпитопов для иммуномечения. В таких случаях инкубируйте кости в 4% параформальдегиде при комнатной температуре (ОТ) в течение 2 ч, в зависимости от инструкции производителя по иммуногистохимии. Фиксация также может быть выполнена с помощью перфузии сердца для удаления кохлеарной крови, избегая фонового шума из-за неспецифического окрашивания на более поздних стадиях, особенно у мышей с кохлеарной синаптопатией.
4. Промойте кости три раза в течение 5 мин 0,1 М холодным PBS для удаления остатков параформальдегида. Декальцинируйте кости с помощью 10% этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) при ОТ в течение 4 ч или при 4 °C в течение 24 ч путем легкого встряхивания в горизонтальном вибростенде при 20 об/мин. ЭДТА может быть обновлена на полпути.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время декальцинации зависит от концентрации EDTA и предпочтений пользователя. Декальцинированная ткань должна сохранять определенную степень прочности, что облегчает манипуляции с изоляцией целых кохлеарных креплений на более поздних этапах. Височные кости могут быть декальцинированы в 10% ЭДТА с вращением, что позволяет исследователям покидать лабораторию после тестов ABR и экспериментов по фиксации. Время декальцинации является гибким в диапазоне от 20 до 30 часов при температуре 4 °C.
5. Пересадите одну декальцинированную височную кость из ЭДТА в 0,1 М PBS. С помощью щипцов Дюмона #3 и #5 и иглы 27 G поочередно рассеките апикальную, среднюю и базальную кохлеарную области, а затем рассеките улитку из кости под стереодиссекционным микроскопом. Сделайте ряд небольших надрезов вдоль спиральной связки с помощью бритвенного лезвия и удалите текториальную мембрану и мембрану Рейсснера (рис. 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: До тех пор, пока рассеченная улитка не повреждена, этот процесс может быть изменен в соответствии с обычным протоколом конкретного оператора.
6. Далее рассекайте оставшийся слуховой эпителий, включая спиральный лимб, на отдельные кохлеарные повороты (вершина, середина и основание с областью крючка) для цельного препарирования.
7. С помощью 40-кратного масляного объектива светового микроскопа измерьте длину базилярной мембраны с помощью шкалы 250 мкм, помещенной в окуляр, которую можно регулировать вдоль стереоцилий ИГХ.
8. Рассчитайте длину каждого поворота улитки, сложив длины всех сегментов (250 мкм на сегмент), и одновременно получите общую длину базилярной мембраны, сложив длины каждого витка.
9. Преобразуйте общую длину базилярной мембраны, включая область крючка, в проценты в зависимости от расстояния от вершины улитки (0% относится к вершине улитки, 100% — к основанию улитки).
10. Преобразуйте это расстояние в частоту кохлеарной характеристики с помощью логарифмической функции (d(%) = 1 - 156,5 + 82,5 × log(f) с наклоном частоты 1,25 мм/октава, где d - нормированное расстояние от вершины улитки в процентах, f - частота в кГц), как описано ранее. Таким образом, может быть получен частотный диапазон в соответствующей области базилярной мембраны на каждом повороте улитки.

4. Иммунофлуоресцентное окрашивание

1. После вскрытия поместите каждый поворот улитки в отдельную центрифужную пробирку объемом 2,5 мл и инкубируйте повороты улитки в 10% козьей сыворотке/PBS/0,1% Triton X-100 в течение 1 часа в режиме РТ на ротаторе.
2. Удалите вышеуказанный раствор для блокирования/пермеабилизации из каждой пробирки с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл под диссекционным микроскопом и инкубируйте образцы с первичными антителами, разведенными в 5% козьей сыворотке/PBS/0,1% Triton X-100 в течение ночи при 4 °C на ротаторе.
   Примечание: Для иммуномаркирования кохлеарных синаптических лент используйте мышиный антикарбоксил-концевой связывающий белок 2 IgG1 (CtBP2, мечущий В-домен скаффолдингового белка RIBEYE, 1:400) и постсинаптический маркер мышиного антиглутаматного рецептора 2 IgG2a (GluR2, мечущий субъединицу α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты или рецептора AMPA, 1:200).
3. Промыть три раза в течение 5 мин холодным PBS 0,1 М для удаления остаточных первичных антител и инкубировать образцы со вторичными антителами, разведенными в 5% козьей сыворотке/PBS/0,1% Triton X-100 при РТ в течение 2\u20123 ч в темноте на ротаторе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте соответствующие смеси вторичных антител с использованием козьего антимышиного Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) и козьего антимышиного Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500), которые являются комплементарными к первичным антителам, используемым на этапе 4.2. Для повышения эффективности мечения синаптических лент рекомендуется выбирать специфические вторичные антитела. Некоторые лаборатории продлевают инкубацию вторичными антителами для повышения иммуномаркировки GluR2.
4. Промыть три раза в течение 5 мин 0,1 М PBS для удаления остаточных вторичных антител и перенести образцы из центрифужных пробирок объемом 2,5 мл на планшеты 35 мм, содержащие 0,1 М PBS.
5. Поместите каплю монтажного материала, содержащего 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), на предметное стекло и перенесите образцы из PBS на монтажную среду. Поместите один край покровного стекла на предметное стекло и отпустите, чтобы оно мягко опустилось.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что волосковые клетки обращены вверх и что во время процедуры не происходит сворачивания или скручивания образцов улитки, установите образцы улитки под стереодиссекционный микроскоп.
6. Поместите предметные стекла в предметную коробку при температуре 4 °C на ночь, чтобы дать предметным стеклам высохнуть, а затем сделайте изображение под лазерным конфокальным микроскопом.

5. Морфологическая оценка синапсов кохлеарной ленты

1. Слайды изображений с помощью конфокального микроскопа с тремя лазерами — УФ-диодом 405 нм, аргоновым лазером 488 нм и твердотельным лазером с диодной накачкой (DPSS) с длиной волны 561 нм для возбуждения DAPI (спектр возбуждения 409–464 нм), Alexa Fluor 488 (спектр возбуждения 496–549 нм) и Alexa Fluor 568 (спектр возбуждения 573–631 нм). соответственно.
2. Получение конфокальных z-стеков на расстоянии 8 μм от каждого поворота улитки с помощью масляной иммерсионной линзы с 63-кратным разрешением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После определения все параметры для оцифровки микрофотографий должны быть сохранены и применены единообразно ко всем предметным стеклам.
3. Для подсчета синаптических точек установите z-стеки (размер шага 0,3 мкм) так, чтобы они охватывали всю длину внутренних волосковых клеток (ИГХ), тем самым гарантируя, что все синаптические точки могут быть визуализированы.
4. Объедините изображения, содержащие пункты, в z-стек, чтобы получить проекцию по оси Z, и импортируйте их в программное обеспечение для обработки изображений.
5. Разделите общее количество синаптических точек в каждом z-стеке в определенных частотных областях на количество ИГХ (равное ручному подсчету ядер DAPI), чтобы вычислить количество синаптических точек для каждой ИГХ. В каждой конкретной частотной области усредните все синаптические точки на трех изображениях различных микроскопических полей, содержащих 9–11 ИГХ.
   1. Наметьте область интересов (ROI), включая базолатеральные области каждой IHC, с помощью кнопки выбора от руки. Используйте функцию измерения для автоматической количественной оценки точек и функцию водосбора, чтобы различать близко расположенные друг к другу точки.
   2. После каждого автоматического подсчета выполняйте визуальный осмотр с ручными корректировками, чтобы убедиться в надежности подсчета точек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментаторы должны оставаться в неведении относительно того, происходит ли предметное стекло от вершины, среднего или базального поворота улитки.
6. Визуально оценивайте структуру и распределение синапсов, чтобы вручную изолировать отдельные ИГХ от их соседей с помощью инструмента «Карандаш» (М), чтобы лучше визуализировать архитектуру цитоскелета и синаптическую локализацию.
7. Чтобы проверить сопоставление пресинаптических лент (CtBP2) и постсинаптических рецепторных патчей (GluR2), извлеките воксельное пространство вокруг ленты с помощью инструмента «Прямоугольная область» и изолируйте отдельную ленту с помощью инструмента «Обрезка». Щелкнув по Image > Image Size, получите набор миниатюрных проекций, которые затем можно использовать для идентификации парных синапсов (выглядящих как близко расположенные пары CtBP2-положительных и GluR2-положительных точек) от орфанных лент (без постсинаптических глутаматных рецепторов) (Рисунок 2).
   Примечание: Нормальные кохлеарные синапсы проявляются как комбинированное иммуномечение пресинаптической ленты внутри волосковой клетки (анти-CtBP2) и постсинаптического рецептора глутамата на окончании слухового нерва (анти-GluR2). Некоторые лаборатории используют конфокальные проекции в сочетании с 3D-моделированием для количественной оценки размера или объема синаптического участка. До значительной потери ленточных синапсов, ленты с изменениями в размере или без парных участков глутаматных рецепторов, вероятно, указывают на синаптическую дисфункцию.

Результаты

Рисунок 1: Локализация частоты улитки у мышей. (A) Репрезентативное изображение полностью эксплантированной улитки, которая была рассечена из височной кости под микроскопом стереодиссекции. (B) Улитка мыши разделена на апикальные, средние и базальные повороты, где удаляется боковая стенка улитки. Красные кружки на фрагментах базилярной мембраны улитк...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Кетамина гидрохлорид	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Фуцзянь, Китай	H35020148	100 мг/кг
Ксилазина гидрохлорид	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	Х-1251	10 мг/кг
Аппарат для физиологии ТДТ	Tucker-Davis Technologies, Алачуа, Флорида, США	Система слуховой физиологии III
Программное обеспечение SigGen/BioSig	Tucker-Davis Technologies, Алачуа, Флорида, США	Система слуховой физиологии III
Электрическая прокладка	Развлечения с домашними животными	11072931136
Щипцы Dumont 3#	Fine Science Tools, Северный Ванкувер, Британская Колумбия, Канада	0203-3-ПО
Щипцы Dumont 5#	Fine Science Tools, Северный Ванкувер, Британская Колумбия, Канада	0209-5-ПО
Стереодиссекционный микроскоп	Nikon Corp., Токио, Япония	SMZ1270
Козья сыворотка	ZSGB-BIO, Пекин, Китай	ЗЛИ-9021
Антиглутаматный рецептор 2, внеклеточный, клон 6C4	Millipore Corp., Биллерика, Массачусетс, США	МАБ397	мышь
Очищенный мышиный анти-CtBP2	BD Biosciences, Биллерика, Массачусетс, США	612044	мышь
Alexa Fluor 568 козье антитело IgG1 к мышам	Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс, США	А21124	коза
Alexa Fluor 488 антитело к мышам IgG2a для коз	Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс, США	А21131	коза
Монтажная среда, содержащая DAPI	ZSGB-BIO, Пекин, Китай	ЗЛИ-9557
Конфокальная флуоресцентная микроскопия	Leica Microsystems, Вецлар, Германия	TCS SP8 II
Программное обеспечение Image Pro Plus	Media Cybernetics, Бетесда, штат Мэриленд, США	Версия 6.0
Профессиональный диагностический карманный отоскоп	Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Шанхай, Китай	ХС-ОТ10
Игольчатый электрод	Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Сиань, Китай	1029	20 мм, 28 г
Динамик с закрытым полем	Tucker-Davis Technologies, Алачуа, Флорида, США	КФ1