Оценка взаимодействия глутаматергических нейронов и клеток глиомы в кокультуре

Аннотация

Источник: Fuchs, Q. et. al., Совместное культивирование глутаматергических нейронов и педиатрических клеток глиомы высокой степени злокачественности в микрофлюидные устройства для оценки электрических взаимодействий. J. Vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует оценку электрической активности нейронов в ко-культуре корковых глутаматергических нейронов и клеток глиомы, полученных из hiPSC, с использованием микрофлюидного устройства с многоэлектродной матрицей.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Протокол совместной культуры

1. Отрегулируйте день посева и концентрацию для клеточных линий UW479 и BT35 так, чтобы достичь 80% сливающихся клеток на момент начала совместного культивирования, что соответствует 21 дню культивирования глутаматергических нейронов.
2. Трипсинизируйте клетки UW479 и BT35 и засейте их на вершине глутаматергических нейронов в каждом специализированном микрофлюидном устройстве (с целевой плотностью 900 клеток/^мм2 для каждого типа клеток) перед посевом педиатрических высокодифференцированных глиом (pHGG) в микрофлюидное устройство, содержащее зрелые глутаматергические нейроны.
3. Сокультуры выдерживают в течение 2 дней в контролируемой среде (37 °C, 5%_CO2) с глутаматергическим нейроном Day11 и последующей средой, подробно описанной в таблице 1.
4. Подсчитывайте клетки pHGG с помощью микроскопических изображений, проанализированных с помощью программного обеспечения для анализа изображений, чтобы оценить их жизнеспособность. Рассчитайте процент ячеек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующую формулу: 100 - ((количество ячеек в D23 / количество ячеек в D21) x 100).

2. Электрофизиологическая запись

1. Выполните электрофизиологическую регистрацию с помощью коммерческой системы и коммерчески доступного программного обеспечения.
   заметка: Эксперименты проводились с использованием многоэлектрической матрицы (МЭА), состоящей из электродов диаметром 30 мкм, расположенных на расстоянии 100 мкм.
2. Проведите первую электрофизиологическую регистрацию глутаматергических нейронов в точке D21 до посева клеток pHGG. Используйте дифференцированные глутаматергические нейроны в качестве контроля и культивируйте их отдельно параллельно с сокультурой. Выполните повторную запись для обоих условий, как описано на следующем шаге под номером 3.
3. Выполните вторую электрофизиологическую регистрацию в D23 (после 2 дней совместного культивирования).

Таблица 1: Состав питательных сред для глутаматергических нейронов, полученных из hiPS.

Компоненты	Среда для посева	D4 средний	D7 средний	D11 и далее средний
DMEM/F-12 Средний	В 0,5 раза	В 0,25 раза	В 0,125 раза	Ø
Нейробазальная среда	В 0,5 раза	В 0,25 раза	В 0,125 раза	Ø
Среда BrainPhys	Ø	В 0,5 раза	В 0,75 раза	1x
Добавка SM1	1x	1x	1x	1x
N2 Добавка-А	1x	1x	1x	1x
Ala-Gln (GlutaMax)	0,5 мМ	0,5 мМ	0,5 мМ	0,5 мМ
БДНФ	10 нг/мл	10 нг/мл	10 нг/мл	10 нг/мл
ГДНФ	10 нг/мл	10 нг/мл	10 нг/мл	10 нг/мл
ТГФ-β1	1 нг/мл	1 нг/мл	1 нг/мл	1 нг/мл
Гельтрекс	30 мкг/мл	Ø	Ø	Ø
Добавка для посева	1x	Ø	Ø	Ø
День 4 Доплата	Ø	1x	Ø	Ø

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
256MEA100/30iR-ITO-w/o	МКС	256MEA100/30iR-ITO-w/o
Щуп 40 μм для счетчика Scepter	Датчер	53750
Щуп 60 μм для счетчика Scepter	Датчер	51999
Ala -Gln (GlutaMAX)	сигма	Г8541
Шкаф биологической безопасности класса II	Термо Сайентиал	HERASafe тип KS12
Корковые глутаматергические нейроны	BrainXell	БХ-0300
DMEM/F12 Средний	сигма	Д8437
ДПБС 1Х	Датчер	Л0615-500
Колбы для клеточных культур EasYFlaskTM 75см3	Нунк	156499
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Датчер	500105
ГДНФ	Пепротех	450-10
Гельтрекс	Технологии Life	A1413201
BDNF человека	Пепротех	450-02
инкубатор	Меммерт	IC0150med
MEA2100	МКС	181205-MEA2100-11240
Микропипетка P10	Сарториус	ЛХ-729020
Микропипетка P100	Сарториус	ЛХ-729050
Микропипетка P1000	Сарториус	ЛХ-729070
Микропипетка P200	Сарториус	ЛХ-729060
Микропробирка Eppendorf 1,5 мл Safe-Lock	Датчер	No 33290 (Английский
Многоканальный экспериментатор	МКС	- T
N2 Добавка-А	Стволовые клетки	7152
Нейробазальная среда	Технологии Life	21103049
Нейрокульт SM1 нейрональная добавка	Стволовые клетки	5711
Заменимые аминокислоты (NEAA) без L-глютамина	Датчер	Х0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity	Драммонд	4000202/4038202
Пипетка для культивирования клеток 10 мл Falcon®	Датчер	357551
Пипетка для культивирования клеток 5 мл Falcon®	Датчер	357543
Мемориальная доска шоффанте (CultureTemp)	Беларт	370151000
Поли-D-лизин	сигма	П6407
Микроскоп Primovert	Цейсс	415510-1100-000

г. )