Имплантация электродной решетки и оптического волокна в гиппокамп мыши

Abstract

Источник: Bender, F., et. al., Оптогенетическое увлечение тета-колебаний гиппокампа у ведущих себя мышей. J. Vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует стереотаксическую имплантацию матрицы проволочных электродов и оптического волокна в гиппокамп модели мыши.

Protocol

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Получение оптических волокон (Рисунок 1A)

1. Используйте многомодовое оптическое волокно (сердечник 105 мкм, стеклянный с сердечником из кварца, 0,22 NA). Снимите оболочку размером 125 мкм с сердцевины волокна с помощью микростриппера, пока волокно все еще прикреплено к катушке с волокнами.
2. Разрежьте волокно на длину примерно 2-3 см с помощью алмазного ножа.
3. Вставьте волокно в керамический наконечник из диоксида циркония (ID: 126 μm). Примерно 0,5-1 мм оптического волокна должно выступать из выпуклой стороны наконечника.
4. С помощью иглы нанесите по одной капле эпоксидного клея на оба конца наконечника, но не на боковые стороны наконечника. В качестве альтернативы используйте суперклей.
5. Дайте клею высохнуть не менее 30 минут.
6. Отполируйте выпуклую сторону обжима с помощью алмазной притирочной пленки для полировки (зернистость 3 мкм).
7. Проверьте точность передачи света с помощью измерителя оптической мощности.
   1. Установите длину волны на измерителе мощности на ту же длину волны, что и используемый лазер.
   2. Расположите патч-корд наконечником к центру датчика. Включите лазер и считайте световой поток с измерителя мощности. Запишите значение.
   3. Подключите оптическое волокно к патч-корду через ответную втулку и расположите его кончиком волокна лицом к центру датчика. Включите лазер и считайте световой поток с измерителя мощности. Запишите значение.
   4. Рассчитайте скорость передачи, разделив второе значение на первое. Если скорость передачи ниже 0,5, выбросьте волокно; В противном случае используйте его для имплантации.
   5. Проверьте скорость передачи для каждого волокна перед имплантацией.
   6. Для последующих экспериментов отрегулируйте интенсивность света лазера в соответствии со скоростью передачи оптического волокна: установите светоотдачу от наконечника патч-корда на 5-15, деленную на скорость пропускания, чтобы достичь конечного светового потока от наконечника волокна в 5-15 мВт.

2. Подготовка массивов вольфрамовых проводов для записи LFP (Рисунок 1B)

1. Приклейте несколько (например 6) 100 мкм направляющих трубки из кремнезема параллельно липкой стороне куска ленты. Отрежьте одну деталь, примерно 4-6 мм, для одной сборки массива проводов.
2. Продеть вольфрамовые проволоки формваром 45 мкм через направляющие трубки с помощью щипцов.
3. Зачистите шесть тонких медных соединительных проводов с эмалированной изоляцией (длиной около 5 мм) и заземляющий провод (длиной примерно 2-3 см), соскоблив с помощью скальпеля изоляцию с обоих концов. Припаяйте их к контактам наноразъема.
4. Соедините каждый соединительный провод с одной вольфрамовой проволокой, используя одну каплю серебряной проводящей краски соответственно. Дайте высохнуть не менее 30 минут.
5. Нанесите минимальное количество цемента для покрытия проводов. Не наносите цемент на вольфрамовые провода, которые будут вставлены в ткани мозга, или на верхнюю часть наноразъема. Дайте цементу высохнуть не менее 30 минут.
6. Выполните угловой рез (5-20°) вольфрамовых проводов с помощью тупых ножниц из нержавеющей стали, чтобы обеспечить надежную имплантацию проводов ниже или выше вентрально прилегающей к пирамидальному слою зоны, где тета-амплитуда слишком мала для оценки точности захвата.
7. Обеззолите наконечник (примерно 2 мм) провода заземления, соскоблив изоляцию с помощью скальпеля. Обработайте его флюсом и предварительно припойте.
8. Проверяйте потенциальные перекрестные помехи между электродами с помощью цифрового мультиметра. Подключите контакты разъема к мультиметру, который должен быть установлен в режим измерения сопротивления. Проверка попарных комбинаций каналов; показания мультиметра ниже 5 МОм указывают на значительные перекрестные помехи.
9. Используйте импедансметр для проверки импеданса каждого проволочного электрода в физиологическом растворе. Типичные значения импеданса составляют менее 100 кОм.
10. Чтобы облегчить имплантацию, приклейте одно оптическое волокно к проволочной решетке так, чтобы кончик волокна находился на уровне самой короткой проволоки, а кончик волокна находился в непосредственной близости, но не касался вольфрамовых проводов. Держите угол наклона волокна как можно меньше, чтобы предотвратить повреждение тканей во время имплантации.

3. Стереотаксические имплантации

1. Удалите соединительную ткань с верхней части черепа и тщательно надавите на мышцы шеи примерно на 2 мм, чтобы предотвратить мышечные артефакты во время записи.
2. Очистите череп с помощью аппликатора с ватным наконечником и физиологического раствора и просверлите четыре отверстия (2 спереди и два над мозжечком, диаметром 0,8 мм) для установки винтов из нержавеющей стали для кости (00-96x1/16) для заземления и стабилизации имплантата (Рисунок 1D). Расположите винт заземления, подсоединенный к одному медному проводу (примерно 2-3 см в длину) над мозжечком.
3. Полностью заземлите винт цементом, чтобы предотвратить мышечные артефакты во время электрофизиологической записи. Соорудите цементное кольцо, соединяющее все винты (Рисунок 1E).
4. Выполните трепанацию черепа над стороной имплантации (гиппокамп, AP -1,94, L 1,4, V 1,4 по отношению к брегме). Нанесите примерно 5 мкл стерильного NaCl на поверхность мозговой ткани.
5. Медленно опустите решетку проводов с помощью стереотаксиса в месте трепанации черепа. Для унитарной записи вживите силиконовый зонд вместо проволочной матрицы. Чтобы предотвратить артефакты оптоэлектрического света, имплантируйте оптическое волокно отдельно в гиппокамп так, чтобы кончик волокна не был обращен непосредственно к зонду (рис. 1C—I). Для исследования координации увлечения между полушариями необходимо имплантировать дополнительное оптическое волокно в контралатеральную область гиппокампа CA1.
6. Для защиты тканей мозга нанесите примерно 5 μL теплого жидкого воско-парафинового масла, предварительно нагретого до 70 °C, с помощью шприца над местом имплантации.
7. Нанесите цемент вокруг проволочного массива и залейте череп цементом.
8. Нанесите одну каплю флюса на предварительно припаянный заземляющий/опорный провод и предварительно припаянный провод, подключенный к винту заземления, например, с помощью иглы, и соедините провода с помощью паяльной машины.
9. Закройте весь провод заземления цементом.
10. Вводите 0,3 мл эрицина (1:4 в стерильном NaCl) и карпрофена (5 мг/мл) внутримышечно после операции и в течение как минимум двух дней после нее. Мышь обычно просыпается в течение 15 минут после операции. Согрейте животное красной лампой, чтобы ускорить выздоровление.
11. Ежедневно контролируйте вес мыши в течение первой недели после операции или до тех пор, пока он не стабилизируется. Потеря веса не должна превышать 10% от зарегистрированного до операции веса мыши. Чтобы ускорить стабилизацию веса, в первые дни после операции кормите мышь влажным кормом и сгущенным молоком.
12. Для регистрации клеточной активности гиппокампа во время увлечения необходимо вживить в гиппокамп силиконовый зонд (AP -1,94, L 1,4, V 1, с последующим опусканием) (рис. 1C—I). Имплантировать оптическое волокно в гиппокамп в точке AP -3, L 1,4, V 1,6, 39° каудально-рострально. Если требуется стимуляция клеточных сомат, имплантируйте дополнительное оптическое волокно в МС (AP +0,98, L 1, V 3,9, 15° латерально).

Results

Рисунок 1: Иллюстрация оптических волокон, электродов и хирургии. (А) Иллюстрация оптического волокна. (B) Иллюстрация проволочной решетки, приклеенной к оптическому волокну для регистрации LFP гиппокампа во время увлечения тета-колебаний гиппокампа. (В) Для регистрации клеточной активности гиппокампа на микропривод устанавливается силиконовый зонд. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Мыши PV-Cre	Лаборатория Джексона	В6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
Стереотаксис	David Kopf Instruments, Туджунга, Калифорния, США	Модель 963	Сверхточный стереотаксический инструмент для мелких животных
Сверла, 0,8 мм	Bijoutil, Альшвиль, Швейцария	49080НМ
Паяльная станция	Weller Tools GmbH, Безигхайм, Германия	ВСД 81
Эритромицин	Rotexmedica GmbH, Триттау, Германия	PZN: 10823932	1г порошка для раствора для инфузий
Прецизионный дрели/шлифовальный станок	Proxxon, Wecker, Люксембург	FBS 240/E
Многомодовое оптическое волокно	ThorLabs, Дахау, Германия	FG105LCA	0,22 NA, Low-OH, сердечник Ø105 μм, 400 - 2400 нм
Керамический наконечник для палочек	Precision Fiber Products, Милпитас, Калифорния, США	CFLC126	Керамический наконечник LC MM, ID 126 мкм
Полировальная бумага	Торлабс	LF3D	6 x 6 дюймов алмазный притирочный (полировочный) лист
Измеритель мощности	Торлабс	ПМ100Д	Компактная консоль измерителя мощности, цифровой 4-дюймовый ЖК-дисплей
Многомодовый оптоволоконный ответвитель	Торлабс	ФСМ50-50А-ФК	Соединитель 1x2 мм, соотношение 50:50, волокна GI 50 мкм, FC/PC
Волоконно-оптический патч-корд	Торлабс	FG105LCA CUSTOM-MUC	изготовлен на заказ, длиной 3 м, с защитной трубкой, трубка: FT030, разъем 1: FC/PC, разъем 2: керамический наконечник 1,25 мм (LC)
рукав	Precision Fiber Products, Милпитас, Калифорния, США	АДАЛ1	Керамическая разъемная сопрягаемая втулка для наконечников Ø1,25 мм (LC/PC)
Вольфрамовая проволока	California Fine Wire Company, Гровер-Бич, Калифорния, США	CFW0010954	40 мкм, 99,95%
Капиллярные трубки	Оптроника	1068150020	Внутренний диаметр: 100.4 μм
Наноконнектор Omnetics	Omnetics Connector Corporation, Миннеаполис, США	А79038-001
Винты	Bilaney, Дюссельдорф, Германия	00-96х1/16	нержавеющая сталь
Серебряная проводящая краска	Conrad electronics, Германия	530042
Жидкостный флюс	Felder GMBH Löttechnik, Оберхаузен, Германия	Lötöl ST	DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)