Оптогенетический контроль динамики сети гиппокампа

Аннотация

Источник: Manseau, F., et al. Настройка в тета-полосе гиппокампа in vitro: методологии записи из септогиппокампального круга изолированных грызунов. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует метод использования оптогенетики для модуляции динамики сети гиппокампа путем активации генетически модифицированных светочувствительных интернейронов в срезе мозга мыши, улучшения синхронизации тета-колебаний и изучения поведения нейронных цепей.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Оптогенетический контроль в изолированном гиппокампе
   Примечание: Для оптогенетического контроля активности сети гиппокампа здесь используется стратегия, специфичная для типа клеток, включающая ритмическую активацию ГАМКергических клеток, содержащих PV (парвальбумин-положительные), поскольку было показано, что эти клетки играют важную роль в синхронизации основных клеточных популяций в изолированном гиппокампе. Селективная экспрессия возбуждающего каналродопсина-2 (ChR2) в PV-клетках достигается путем скрещивания линии мышей PV-Cre с мышами, конститутивно экспрессирующими ChR2 Cre-зависимы (Ai32), тем самым порождая мышей PV-ChY. В качестве альтернативы, вирусные векторные конструкции (например, AAVdj-ChETA-eYFP) могут быть введены в гиппокамп мышей PV-Cre или PV-TOM (P15-16) для стимуляции экспрессии возбуждающего опсина в интернейронах CA1/SUB (рис. 1A).
   1. Поместите электрод LFP в область CA1/SUB (Cornu ammonis-1/subiculum) и заплатите соседнюю пирамидальную клетку в изолированном гиппокампе мыши, экспрессирующей чувствительный к синему свету возбуждающий опсин ChR2 в интернейронах ФВ.
   2. Поместите световод из оптического волокна (диаметром 0,2 - 1 мм) над препаратом гиппокампа и центрируйте его на записанной области. Используйте синий свет (473 нм) от светодиодного источника для оптогенетической стимуляции, состоящий из световых импульсов (10 - 20 мс, запускаемых транзисторно-транзисторным логическим сигналом) или синусоидальных вольт-команд, подаваемых на тета-частотах (4 - 12 Гц).
   3. Переключитесь на токовый зажим и охарактеризуйте активность пирамидального во время спонтанных тета-колебаний.
   4. Запустите протокол стимуляции и запишите реакцию света. Обратите внимание, что колебания поля и синаптическая активность в зарегистрированном нейроне становятся все более синхронизированными во время оптогенетической стимуляции, и что ритмичное движение ФВ-клеток приводит к надежному контролю как частоты, так и мощности тета-колебаний (рис. 1).

Результаты

Рисунок 1: Локальный потенциал поля и одновременная запись патч-зажима от одиночных пирамидальных и PV нейронов CA1/SUB во время спонтанных и оптогенетически обусловленных тета-колебаний в изолированном гиппокампе.

(a) Диаграмма, показывающая места записи LFP и патч-электродов с размещением световода над областью CA1/SUB, экспрессирующей чувствительный к с...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагентов
Хлорид натрия	Сигма Олдрич	С9625
сахароза	Сигма Олдрич	С9378
Бикарбонат натрия	Сигма Олдрич	С5761
NaH2PO4 - одноосновной фосфат натрия	Сигма Олдрич	С8282
Сульфат магния	Сигма Олдрич	М7506
Хлористый калий	Сигма Олдрич	П3911
D-(+)-глюкоза	Сигма Олдрич	Г7528
Дигидрат хлорида кальция	Сигма Олдрич	С5080
Аскорбат натрия	Сигма Олдрич	А7631-25Г
оборудование
Газовая смесь 95% O2/5% CO2 (карбоген)	Виталер	SG466204A	перфузионная система
Стеклянные бутылки/колбы (4 x 1 л)	н.а.	н.а.	перфузионная система
Погружная записывающая камера	индивидуальный дизайн (FM)	н.а.	Может быть использована коммерческая альтернатива
Усилитель с патч-клэмпингом Multiclamp 700B	Молекулярные устройства	МУЛЬТИЗАЖИМ	Электрофизиологии
Программа Multiclamp 700B Commander	Молекулярные устройства	МУЛЬТИЗАЖИМ	Электрофизиологии
Цифровой/аналоговый преобразователь	Молекулярные устройства	ДДИ440	Электрофизиологии
Микроманипуляторы (с ручным управлением)	Сискию	МХ130	электрофизиология (ЛФП)
Микроманипуляторы (автоматизированные)	Сискию	MC1000e	Электрофизиология (пластырь)
Аудиомонитор	Системы А-М	Модель 3300	Электрофизиологии
Изготовленный на заказ вертикальный флуоресцентный микроскоп	Сискию	н.а.	отображение
Аналоговая видеокамера	COHU	4912-2000/0000	отображение
Цифровой фреймграббер с программным обеспечением для обработки изображений	ЭПИКС, ИНК	Разъем PIXCI-SV7	отображение
Объектив Olympus 2,5x	Олимп	МПЛФН	отображение
Объектив Olympus 40x для погружения в воду	Олимп	UIS2 LUMPLFLN	отображение
Система светодиодов (LED) по индивидуальному заказу	обычай	н.а.	оптогенетическая стимуляция (Amhilon et al., 2015)
животные
PV::Cre (KI) мыши	Лаборатория Джексона	Складской номер 008069	Обеспечение Cre-направленной экспрессии генов в PV-интернейронах
Мыши-условные Ai9 (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))	Лаборатория Джексона	Номер акции 007905	Экспресс-TdTomato после Cre-опосредованной рекомбинации
Мыши Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP	Лаборатория Джексона	Номер по каталогу 012569	Экспрессия улучшенного гибридного белка каналродопсин-2/EYFP после воздействия Cre-рекомбиназы
Мыши из ПВХ	В домашнем разведении	н.а.	Потомство, полученное от скрещивания линии PV-Cre с мышами Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP