Оценка функционального нервно-мышечного соединения с помощью одновременной оптической стимуляции и видеозаписи

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Подготовка биореактора

1. Изготовление форм для биореакторов
   1. Загрузите файл CAD (системы автоматизированного проектирования) биореактора из дополнительного файла CAD или создайте индивидуальный проект.
   2. Сгенерируйте траекторию движения инструмента с ЧПУ (числовым программным управлением) на основе 3D-модели с помощью программного обеспечения CAM (автоматизированное производство).
   3. Обрабатывайте ацетальные формы с помощью фрезерного станка с ЧПУ.
2. Изготовление биореакторов
   1. Смешайте основание 10:1 со смесью отвердителя полидиметилсилоксана (PDMS, 77 г смеси на 4 платформы/формы).
   2. Поместите смесь в вакуумную камеру, закройте все клапаны, включите вакуум и дегазируйте смесь в течение не менее 30 минут, пока не останутся пузырьки воздуха. Разлейте смесь по формам и дегазируйте формы в вакуумной камере в течение 1 ч.
   3. Закройте формочки верхней половиной формы в правильной ориентации. Поместите стальной шестигранный стержень над центром и зажмите с обеих сторон.
   4. Заправьте верхнюю часть с помощью PDMS.
   5. Выдержать формы в духовке при температуре 65 °C не менее 4 часов.
   6. Выньте платформы из форм после остывания до комнатной температуры.
   7. Очистите устройства в ультразвуковой ванне, используя 1 час цикла мытья посуды, 400 мл 100% изопропанола и дистиллированной воды.
   8. Сушите в течение ночи при температуре 65 °C.
   9. Замочите стеклянные покровные стекла в 1% неионогенном поверхностно-активном полиоле на 30 минут, следя за тем, чтобы они не слиплись, чтобы все они были должным образом покрыты.
   10. Хорошо промойте дистиллированной водой и высушите в течение ночи при температуре 65 °C.
   11. Стеклянные покровные стекла и платформу PDMS обработать плазменным очистителем на высокой мощности с 6 л/мин кислорода в течение 1-2 минут. После обработки соедините их вместе, прижав PDMS к покровному стеклу не менее чем на 30 секунд.
   12. Перед добавлением ячеек склеивайте устройства в автоклаве
   .

2. Построение установки для оптической стимуляции

1. Используя систему кубов с клеткой 30 мм, прикрепите дихроичное зеркало с длиной волны 573 нм в центре. Соедините красный светодиод с длиной волны 627 нм (светоизлучающий диод) с длинночастотным фильтром возбуждения 594 нм и прикрепите его к верхней стороне куба так, чтобы светодиод был обращен к зеркалу. Затем прикрепите синий светодиод с длиной волны 488 нм и короткочастотным фильтром возбуждения 546 нм к соседней стороне куба так, чтобы светодиод был обращен к зеркалу, как показано на схеме на рисунке 1A.
2. Прикрепите ирисовую диафрагму с кольцевым приводом к нижней части куба клетки, чтобы контролировать размер освещаемой области.
3. Питание каждого светодиода осуществляется с помощью светодиодного драйвера T-Cube и управления с помощью платы Arduino Uno Rev3. Подключите боковой вход светодиодного драйвера к вилке источника питания, подключите средний выход к Arduino и подключите боковой выход непосредственно к светодиодам.
4. Подключите Arduino Uno к компьютеру с помощью USB-кабеля.
5. Скачать файлы с GitHub можно по ссылке (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
6. Откройте файл "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" из папки GitHub.
7. Установите начальные параметры: Steps = 30; startFrequency = 0.5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
8. Убедитесь, что выход контакта 4 назначен драйверу синего светодиода, а выход контакта 2 назначен драйверу красного светодиода. Убедитесь, что средние провода светодиодного драйвера подключены к земле и к соответствующему контактному выходу.
9. Скомпилируйте и загрузите программу "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" в Arduino.
10. Подключите каждый светодиодный драйвер к соответствующему каналу.

3. Настройка клеточной культуры (день -21-0)

1. Первичные клетки скелетных мышц
   1. Разморозьте и разморозьте первичные скелетные миобласты (полученные из миозита Кука) максимум на шесть пассажей с использованием миотонической питательной среды (+ добавка). Поддерживайте клетки в инкубаторе при температуре 37 °C и 5%_CO2.
   2. Меняйте носители каждые 2 дня.
   3. Как только клетки соберутся примерно на 60%, пропустите их, используя 0,05% трипсин-ЭДТА (1x, в течение 5 минут при 37 °C). Соберите диссоциированные клетки и добавьте свежую среду для нейтрализации трипсина.
   4. Раскрутите клетки при давлении 300 x g и аспирируйте надосадочную жидкость над клеточной гранулой.
   5. Ресуспендируйте клетки с помощью MGM и затравите 1:3 по 60 мл в трехслойной колбе.
2. ChR2-hiPSC
   заметка: Все клеточные линии для этой работы были созданы и использованы в соответствии с институциональными рекомендациями Колумбийского университета, штат Нью-Йорк, США. В этом протоколе ChR2-экспрессирующие ИПСК были получены путем редактирования генома CRISPR-Cas9 с использованием ранее описанных методов18, но таким же образом могут быть использованы любые стабильные оптогенетические клеточные линии (лентивирусные, piggyBac и др.). Были выбраны конститутивные промоторы, экспрессируемые как в иПСК, так и в мотонейронах (КАГ). Было обнаружено, что клетки имеют здоровые кариотипы, как отмечалось в предыдущих публикациях.
   1. Покройте 6-луночные планшеты 1 мл на лунку растворенной матрицей базальной мембраны, разведенной в DMEM/F12 (1:80) и инкубируйте планшеты при комнатной температуре в течение 1 ч.
   2. Посев iPSCs на покрытые 6-луночные планшеты 2 мл среды для культивирования клеток без питательных веществ (iPSC medium), заменяя 2 мл среды через день и проходя каждые 5-7 дней. Поддерживайте клетки в инкубаторе при температуре 37°C и 5%_CO2.
   3. Пассирование
      1. Диссоциируйте стволовые клетки, инкубируя их с 1 мл реагента для высвобождения стволовых клеток, не содержащего ферментов, в течение 4 минут и механически срезая их с помощью пипетки P1000 с широким наконечником.
      2. Затравочные клетки в соотношении 1:24 или 1:48 в среде iPSC с 2 мкМ дигидрохлорида Y-27632 в концентрации 2 мл/лунка на покрытые 6-луночные планшеты.

4. Посев скелетной мышечной ткани (день -3)

1. Выделите и подсчитайте 30 x 106 миобластов с помощью автоматического счетчика клеток.
2. Ресуспендируйте миобласты в соотношении 4:1 из 3 мг/мл коллагена I и солюбилизированной матрицы базальной мембраны (800 мкл коллагеновой смеси + 200 мкл матрицы базальной мембраны для достижения конечного объема 1 мл). В качестве коллагенового компонента добавьте сопутствующий нейтрализующий агент (смесь коллагена к нейтрализующему агенту 9:1) и разбавьте смесь 1x PBS для достижения объема 800 μл.
3. Добавьте по 15 мкл суспензии клеточного коллагена в каждую мышечную камеру биореактора, распределив суспензию по обоим столбам с помощью наконечника пипетки (рис. 2).
4. Дайте клеточно-гелевой смеси полимеризоваться при 37 °C в течение 30 минут, а затем заполните каждую лунку биореактора 450 μL миотонической питательной среды.
5. Через 3 дня (после того как гель уплотнится) начните дифференцировку миотрубки.

5. Дифференцировка миотрубки (дни 0-14)

1. Начните инфузию миотрубки с переключения тканей на 450 мкл среды, вызывающей слияние (FS, Таблица 1) в течение 7 дней, меняя среду через день.
   заметка: Попробуйте начать дифференцировку миотрубков в тот же день, что и дифференцировку мотонейронов от ИПСК для того, чтобы засеять мотонейроны в конце графиков дифференцировки обоих типов клеток.
2. На 7-й день смените среду на 450 мкл среды созревания Ia (MMIa, табл. 1).
3. На 9-й день замените на 450 мкл среды созревания Ib (MMIb, табл. 1).
4. На 11-й день смените носитель на 450 мкл NbActiv4. Продолжайте менять среду каждые 2 дня, пока мотонейроны не будут засеяны (Шаг 7).

6. Дифференциация мотонейронов (дни 0-14)

1. В день 0 перенесите 4 x 10⁶ ChR2-hiPSCs в чашку Петри со сверхнизким уровнем прикрепления с 15 мл питательной среды для суспензии мотонейрона (MSCM, Таблица 1). Дополните МСКМ 3 мкМ CHIR99021, 0,2 мкМ LDN193189, 40 мкМ SB431542 гидрата и 5 мкМ Y-27632 дигидрохлорида.
2. На 2-й день изолируйте нейросферы (НС) с помощью обратимого сита с концентрацией 37 мкМ и повторно поместите в 15 мл МСКМ 3 мкМ CHIR99021, 0,2 мкМ LDN193189, 40 мкМ SB431542 гидрата и 0,1 мкМ ретиноевой кислоты. После 2-го дня НС должна быть видна в чашке Петри без использования микроскопа.
3. На 4-й день перенесите клетки и среду в пробирку объемом 50 мл и дайте нейросферам осесть на дно (5 минут). Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 15 мл МСКМ с добавлением 0,5 мкМ SAG, 0,2 мкМ LDN193189, 40 мкМ SB431541 и 0,1 мкМ ретиноевой кислоты.
4. На 7-й день повторите шаг 6.3, но ресуспендируйте клетки в 15 мл МСКМ с добавлением 0,5 мкМ SAG и 0,1 мкМ ретиноевой кислоты.
5. На 9-й день повторите Шаг 6.3, но ресуспендируйте клетки в 15 мл МСКМ с добавлением 10 мкМ DAPT.
6. На 11-й день повторите шаг 6.3, но повторно суспендируйте клетки в 15 мл МСКМ с добавлением 20 нг/мл BDNF и 10 нг/мл GDNF.
7. На 14-й день засейте мотонейроны в платформу.

7. Посев агрегатов мотонейронов в биореакторе (день 14)

1. Приготовьте гелевую смесь 4:1 из 2 мг/мл коллагена I и Matrigel (800 μл коллагеновой смеси + 200 μL Matrigel для достижения конечного объема 1 мл). В качестве коллагенового компонента добавьте сопутствующий нейтрализующий агент (смесь коллагена к нейтрализующему агенту 9:1) и разбавьте смесь 1x PBS для достижения конечного объема 800 μл.
2. С помощью клеточного фильтра с длиной волны 400 нм выберите крупные нейросферы и ресуспендируйте их в гелевой смеси.
3. Отсасывайте среды из резервуара и осторожно из скважины нейросферы (рисунок 2).
4. Добавьте 15 мкл гелевой смеси в канал нейросферы.
5. Загрузите в пипетку объемом 10 мкл 10 мкл геля, а затем выберите одну нейросферу.
6. Поместите NS в канал нейросферы и убедитесь, что NS находится в камере. Медленно поднимите пипетку, выпуская оставшийся гель после осаждения НС. Если вы не уверены, что NS был правильно нанесен, проверьте его местоположение с помощью микроскопа.
7. Дайте гелю полимеризоваться в течение 30 минут при 37 °C.
8. В резервуары добавьте 450 мкл NbActiv4 с добавлением 20 нг/мл BDNF и 10 нг/мл GDNF.
9. Меняйте среду через день, чтобы обеспечить рост аксонов от NS к мышечной ткани.

8. Одновременная оптическая стимуляция и видеозапись функции NMJ (день 24+)

1. Для визуализации используйте инвертированный флуоресцентный микроскоп с научной камерой комплементарного металл-оксид-полупроводник (sCMOS).
2. Установите биннинг программного обеспечения камеры на 2x2, экспозицию на 20 мс, роллинг-шаттер вкл., скорость считывания на 540 МГц, динамический диапазон: 12-бит и усиление 1, и режим сенсора: перекрытие.
3. Используйте 2-кратный объектив на микроскопе для визуализации микротканей.
4. Прикрепите к предметному столику микроскопа камеру с живыми клетками (37 °C, 5%_CO2).
5. Выберите область интереса (ROI), которая содержит иннервированную ткань скелетных тканей, чтобы свести к минимуму размер файла и время обработки.
6. Поместите длинночастотный эмиссионный фильтр с длиной волны 594 нм между образцом и объективом изображения, чтобы отфильтровать импульсы синего света от камеры.
7. Поместите прямоугольную 4-луночную пластину, содержащую 4 биореактора (24 ткани), в камеру с живыми клетками.
8. Нажмите «Просмотр в реальном времени». Центрируйте и сфокусируйте изображение с желаемой рентабельностью инвестиций.
9. Загрузите пользовательский код макроса из папки GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) для управления положением рабочей области, платой Arduino и получением видео.
10. Установите выходной фильм как day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
11. Запустите код макроса с нужными координатами X,Y, установленными на рабочей области, и получите быстрый таймлапс с 1700 кадрами со скоростью 50 кадров/с.
12. После визуализации замените носитель и верните образцы в инкубатор. Подождите не менее 24 часов между сеансами получения изображений, чтобы избежать усталости тканей.

Рисунок 1. Стимуляция, регистрация и анализ функции NMJ. (A) Схема установки светодиодов и пути света. (B) Оптическая установка с инвертированным микроскопом, камерой с живыми клетками, автоматизированным столиком и камерой sCMOS. (C) Алгоритм пакетной обработки видео оптической стимуляции культур NMJ. (D) Репрезентативный кадр видео, сгенерированный кодом MATLAB, и соответствующий график трассировки сократимости. Мигающий синий прямоугольник на видео и вертикальные линии на графике указывают, когда происходит стимуляция синим светом.

Рисунок 2. Системы кокультуры для генерации 3D NMJ. (А) Схема микрофлюидной платформы. (B) Схема биореактора PDMS с открытым колодцем. (C) Иннервированная скелетная мышечная ткань в микрофлюидной платформе. (D) Иннервированная ткань в открытом биореакторе. Масштабная линейка 0,5 мм.

Таблица 1. Препараты миогенных и нейронных сред. Организован список факторов роста и БАДов для СМИ.