$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка клеточной линии
- Разморозьте около 1 000 000 клеток спинного мозга нейробластомы мыши (клетки NSC-34), которые хранились в контейнере с жидким азотом. Используйте водный инкубатор с температурой 37 °C до тех пор, пока клетки полностью не разморозятся.
- Добавьте свежую теплую среду (среду DMEM, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% L-глутамина и 1% антибиотиков с пен-стрептококком).
- Центрифуга размораживает ячейки (SL16R) при 500 x g в течение 5 мин, формируя клеточную гранулу. Выбросьте среду и добавьте 1 мл новой среды для ресуспензии клеток.
- Поместите ресуспендированные клетки в колбу объемом 15 мл и добавьте еще 5 мл среды. Инкубируйте клетки в течение ночи в стерильном инкубаторе с 5%CO2 при 37 °C.
- Параллельно поместите 8 защитных стекол без покрытия (покровное стекло: 12 мм, толщина 0,13-0,17 мм) в чашку для культивирования диаметром 60 мм и стерилизуйте с использованием 70% этанола и воздействием ультрафиолетового излучения в течение 30 минут до тех пор, пока они не высохнут. Добавьте средство в каждую посуду и утилизируйте, чтобы смыть остатки этанола.
- Добавьте трипсиновый буфер (2,5 г трипсина и 0,2 г ЭДТА в 1 л сбалансированного раствора соли Хэнкса) к клеткам после того, как они достигнут примерно 90% слияния (примерно 6 миллионов клеток в колбе), чтобы позволить адгезивным клеткам диссоциировать><.
Примечание: Клетки NSC-34 чувствительны и требуют только 15 с инкубации трипсинового буфера и 1 дополнительную минуту инкубации без трипсина перед диссоциацией с использованием среды.
- Поместите клетки на 60-миллиметровые чашки для культур, уже содержащие покровные чашки, с 3 мл среды, примерно 350 000 на чашку. Оставьте их в инкубаторе на 24 часа, чтобы они могли прикрепиться к покровным стеклам.
2. Проверка экспрессии белка
- Поместите на лед 60 мм чашки с культурами, содержащие остаточные клетки (не использованные в описанном выше эксперименте) из каждой опытной группы.
- Утилизируйте среду и дважды промойте ячейки PBS, чтобы разбавить и промыть оставшуюся среду.
- Обработайте клетки 200-400 мкл лизисного буфера, содержащего PBS, 0,5% тритона и коктейльную таблетку ингибитора протеазы (PI). Соскребите с помощью скребка для ячеек.
- Соберите клетки в буфере для лизиса в микроцентрифужной пробирке и гомогенизируйте гомогенизатором при 4000 об/мин в течение 1 минуты подо льдом.
- Центрифугируйте гомогенизированные клетки при концентрации 2500 x g в течение 10 мин. Соберите надосадочную жидкость, количественно определите концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда и храните при температуре -20 °C до использования.
- Соберите от 30 до 70 мкг общего белка (в зависимости от белка) и загрузите его в гель SDS-PAGE для проверки экспрессии белка с помощью иммуноблоттинга.