1. Определение относительной экспрессии белка клеточной поверхности в астроцитах методом биотинилирования
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы иллюстрируем применение этого метода биотинилирования для изучения влияния молекулы внеклеточного матрикса ламинина на локализацию на клеточной поверхности водопроницаемого канала аквапорин-4 (AQP4). Специализированные материалы, необходимые для этого анализа, включают сульфо-NHS-LC-биотин (сульфосукцинимидил 6-(биотинамидо) гексаноат) и стрептавидин-агарозную смолу (см. Таблицу материалов).
- Используя этот метод, подготовьте культуры кортикальных астроцитов примерно за 2 недели до анализа и выращивайте их в 75 см 2 вентилируемых колбах для культур. Когда астроциты будут на 80 - 90% слиты, отделите их от поверхности культуры с помощью 0,05% трипсина, а затем пропустите их 1:3.
- За 48 ч до анализа, когда клетки снова сливаются на 80-90%, астроциты в соотношении 1:3 (с учетом изменения формата культивирования) проходят через 60 мм в чашки для клеточных культур так, чтобы они были на >70% сливающимися в день проведения эксперимента. Следите за тем, чтобы ячейки были равномерно распределены между посудой.
- За 16 ч до анализа пипетку ввели ламинин в культуральную среду до конечной концентрации 24 нМ и инкубировали при 37 °С.
- Непосредственно перед анализом приготовьте следующее, а затем положите на лед или охладите: CM-PBS (100 мг/л MgCl2∙6H2O и 100 мг/л CaCl2 в 1X фосфатно-солевом буфере [PBS], pH 7,4), биотиновый буфер (0,5 мг/мл сульфо-NHS-LC-биотина в CM-PBS), буфер для гашения (50 мМ NH4Cl в CM-PBS), буфер для лизиса (25 мМ Tris, pH 7,4, 25 мМ глицина, 150 мМ NaCl и 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты [ЭДТА], 1% тритон Х-100, 1Х коктейль ингибиторов протеазы), 3Х загрузочный буфер (150 мМ Трис, рН 6,8, 6% додецилсульфат натрия [SDS], 30% глицерин, 300 мМ дитиотреитол [DTT] и 0,01% бромфенол синий) и буфер для промывки (10 мМ Трис (pH 7,4), 1,5 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 1X коктейль ингибиторов протеазы).
- Извлеките из инкубатора чашки, в которой находились культуры астроцитов, и выбросьте среду.
- Вымойте ячейки трижды охлажденным CM-PBS объемом 4 мл и поставьте посуду на колотый лед.
- Внесите 2 мл биотина в буфер в каждую лунку и осторожно наклоните чашку вперед и назад несколько раз, чтобы обеспечить полное покрытие. Оставить на льду на 30 минут.
- Удалите биотиновый буфер с помощью аспиратора и замените его буфером для гашения объемом 4 мл. Оставить на льду на 10 минут.
- Отсадите закалочный буфер и замените его эквивалентным объемом того же объема. Снова оставляем на льду на 10 минут.
- Выбросьте закалочный буфер и трижды промойте ячейки охлажденным CM-PBS объемом 4 мл.
- Соскребите клетки в охлажденный CM-PBS объемом 1 мл с помощью клеточного подъемника и перенесите суспензию в микроцентрифужную пробирку.
- Гранулированные клетки путем центрифугирования при 100 x g в течение 3 мин. Отбросить надосадочную жидкость и повторно суспендировать клетки в 500 мкл буфера для лизиса.
- Оставьте образцы на льду на 30 минут, делая завихрение каждые 5 минут, или поместите их на вращатель «конец над концом» при температуре 4 °C.
- Центрифугируйте лизат при 14 000 x g в течение 10 минут при 4 °C, чтобы гранулировать любые нерастворимые в моющих средствах материалы. Перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку.
- Сохраните 50 мкл этого лизата и добавьте в него загрузочный буфер. Затем денатурируйте его, нагревая до 95 °C в сухой бане; Это «входная» фракция, содержащая как биотинилированные белки клеточной поверхности, так и небиотинилированные цитозольные белки.
- Расширьте отверстие наконечника пипетки, отрезав примерно 0,5 см материала от его конца с помощью острых ножниц. С помощью этого наконечника для дозатора перенесите 75 μл стрептавидин-агарозных шариков (обычно хранящихся при 4 °C) в лизат и инкубируйте при 4 °C в течение 3 часов на шейкере/качалке.
- Поскольку стрептавидин-агароза часто продается в виде суспензии, содержащей 50% гранул по объему, суспендированную в антимикробном растворе, растирать суспензию для обеспечения равномерной суспензии в гранулах, а затем дозировать 150 мкл суспензии в каждый образец.
- Гранулы стрептавидин-агарозы методом центрифугирования при 1500 х г в течение 30 с при 4 °С.
- Сэкономьте 50 мкл надосадочной жидкости (добавьте загрузочный буфер и денатурируйте его при 95 °C на водяной бане или нагревательном блоке); это представляет собой «внутриклеечную» фракцию и состоит в основном из небиотинилированных цитозольных белков.
- Повторно суспендируйте гранулированные шарики в буфере объемом 1 мл и покачивайте в течение 3 минут при температуре 4 °C. Гранулируйте шарики (как в шаге 1.16) и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот процесс 4 раза, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание небиотинилированных цитозольных белков.
- Гранулируйте гранулы центрифугированием (1500 x g в течение 30 с при 4 °C) и выбросьте вышележащий буфер для промывки. Добавьте 50 мкл загрузочного буфера 1X (разбавленного с помощью буфера для лизиса). Высвобождать биотин и стрептавидин из гранул путем денатурации при 95 °C; Эта фракция должна содержать только биотинилированные белки клеточной поверхности (фракция «клеточная поверхность»).
- Разделяйте входящие, клеточные и внутриклеточные фракции с помощью SDS-PAGE (электрофорез в геле додецилсульфата натрия и полиакриламида) и анализируйте с помощью вестерн-блоттинга.
заметка: В то время как в наших экспериментах мы использовали 4-20% сборный градиентный гель, 12-14% разделяющего геля с 4% слоем (каждый из которых содержит 0,1% SDS) должно быть достаточно для белков, представляющих интерес в этом исследовании. Следует также использовать стандарт молекулярной массы соответствующего диапазона размеров. Обратите внимание, что иногда может наблюдаться сдвиг вверх в видимых молекулярных массах биотинилированных белков.