Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Определение скорости интернализации белков клеточной поверхности в астроцитах методом биотинилирования
ПРИМЕЧАНИЕ: Далее мы описываем типичный эксперимент по биотинилированию с погоней за пульсом, используемый в данном случае для отслеживания эндоцитоза AQP4 в астроцитах. К специализированным материалам относятся сульфо-NHS-SS-биотин, стрептавидин-агарозная смола, восстановленный глутатион и йодоацетамид (см. Таблицу материалов).
- Приготовьте культуры корковых астроцитов мыши в 60-мм чашках, используя методы, описанные в предыдущем разделе. Убедитесь, что в день проведения анализа клетки слиты примерно на 70% и что каждая чашка содержит эквивалентное количество клеток.
- Непосредственно перед анализом приготовьте следующее и положите на лед или в холодильник: CM-PBS или фосфатно-солевой буфер (100 мг/л MgCl2∙6H2O и 100 мг/л CaCl2 в 1X PBS, pH7,4), биотиновый буфер (0,5 мг/мл сульфо-NHS-SS-биотина в CM-PBS), восстановительный буфер (50 мМ восстановленного глутатиона, 75 мМ NaCl и 75 мМ NaOH), буфер для гашения (50 мМ йодоацетамида, 1% БСА, в CM-PBS), буфер для лизиса (25 мМ Трис, pH 7,4, 25 мМ глицин, 150 мМ NaCl и 5 мМ ЭДТА или этилендиаминтетрауксусная кислота, 1% тритон X-100, 1X коктейль ингибиторов протеазы), 3X загрузочный буфер (150 мМ Трис, pH 6,8, 6% SDS или додецилсульфат натрия, 30% глицерин, 300 мМ DTT или дитиотреитол и 0,01% бромфеноловый синий), и промывочный буфер (10 мМ Трис, pH 7,4, 1,5 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 1% тритон X-100, 1X коктейль ингибиторов протеазы).
- Приготовьте свежую среду для клеточных культур (модифицированную среду Dulbecco's Modified Eagle Medium; или DMEM с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 1% пенициллина/стрептомицина и 1% L-глутамина) и поместите ее на водяную баню при температуре 37 °C.
- Удалите культуры астроцитов из инкубатора и аспирируйте среду с помощью аспиратора.
- Вымойте клетки трижды охлажденным CM-PBS объемом 4 мл и поставьте посуду на колотый лед.
- Внесите пипеткой 3 мл биотинового буфера в каждую чашку, несколько раз наклоните посуду вперед и назад, чтобы убедиться, что буфер хорошо распределен, и оставьте на льду на 30 минут.
- Аспирируйте биотин буфером, и замените его 5 мл теплой среды. Инкубируйте чашку для культуры при 37 °C в течение 15 минут, а вторую чашку при той же температуре в течение 30 минут. Оставьте другую чашку при температуре 4 °C в качестве образца на 0 минут.
- В конце инкубационного периода выбросьте среду и трижды промойте клетки 4 мл охлажденного CM-PBS. Пипеткой нанесите на клетки 6 мл восстановительный буфер и оставьте их на льду на 15 минут.
- Снимите восстановительный буфер и замените его 6 мл свежего восстановительного буфера. Поместите смесь на лед еще на 15 минут.
- Удалите восстановительный раствор и замените его буфером для закалки объемом 6 мл. Оставить на льду на 15 минут.
- Повторите этап закалки еще раз.
- Выбросьте буфер для закалки и трижды промойте ячейки охлажденным PBS объемом 4 мл.
- С помощью клеточного подъемника соскребите клетки в охлажденный PBS объемом 1 мл и перенесите суспензию в микроцентрифужную пробирку.
- Гранулированные клетки путем центрифугирования при 100 x g в течение 3 мин. Отбросить надосадочную жидкость и повторно суспендировать клетки в буфере для лизиса объемом 500 мкл.
- Оставьте его на льду на 30 минут и делайте вихрь каждые 5 минут. В качестве альтернативы поместите образцы на вращатель «конец над концом» при температуре 4 °C на это время.
- Центрифугируйте лизат при 14 000 x g в течение 10 минут при 4 °C для гранулирования нерастворимых в моющих средствах материалов, затем перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку. Сохраните 50 μл этого лизата, добавьте в него загрузочный буфер и денатурируйте при 95 °C в сухой ванне; Это «входная» фракция, содержащая как биотинилированные эндоцитозированные белки, так и небиотинилированные белки.
- С помощью отрезанного наконечника пипетки добавьте в лизат 150 μл стрептавидин-агарозной суспензии и инкубируйте при 4 °C в течение 3 часов на шейкере/коромысле.
- Гранулы стрептавидин-агарозы методом центрифугирования при 1 500 x g в течение 30 с при 4 °C.
- Повторно суспендируйте шарики в буфере для промывки объемом 1 мл и проведите в породе на 3 минуты при 4 °C. Гранулы гранул (в соответствии с шагом 1.18) и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот процесс 4 раза, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание небиотинилированных цитозольных белков.
- Гранулы гранул центрифугируют при температуре 1 500 x g в течение 30 с при 4 °C и выбрасывают вышележащий буфер для промывки. Добавьте 50 мкл 1X загрузочного буфера (разбавленного с помощью буфера для лизиса). Высвобождение биотина и стрептавидина из гранул путем денатурации при 95 °С; Эта фракция должна содержать только интернализованные белки клеточной поверхности (эндоцитозированная фракция).
- Разделение входной, клеточной поверхности и несвязанной фракции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) и анализ с помощью вестерн-блоттинга.
заметка: В то время как в наших экспериментах мы использовали 4-20% сборный градиентный гель, 12-14% разделяющего геля с 4% слоем (каждый из которых содержит 0,1% SDS) должно быть достаточно для белков, представляющих интерес в этом исследовании. Следует также использовать стандарт молекулярной массы соответствующего диапазона размеров. Обратите внимание, что иногда может наблюдаться сдвиг вверх в видимых молекулярных массах биотинилированных белков.
