$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка матриц
- Отварите 4-8 силиконовых матриц в микроволновой печи или на горячей плите в течение 5 минут и дайте им полностью высохнуть в течение 1 часа под ламинарным потоком (полосатой стороной вверх><).
заметка: Следующие процедуры следует выполнять под ламинарным потоком.
- Продуйте сжатым воздухом или используйте прозрачную липкую ленту, чтобы удалить пыль с полосатой стороны матриц. Следите за тем, чтобы полосатая сторона была чистой, чтобы она могла надежно прилегать к поверхности пластины.
- Аккуратно поместите матрицы на 6-сантиметровую пластиковую посуду, надавливая пальцем (одна матрица на блюдо; полосой вниз). Не допускайте попадания пузырьков воздуха между матрицей и блюдом. Отметьте расположение полосок на нижней стороне чашки для культуры.
- Если матрица не прикрепляется, повторите шаг с 1.2.
2. Генерация полос и ламининовое покрытие для культуры нейронов
- Приготовьте флуоресцентно меченный рекомбинантный белок (по 25 мкл для инъекций [шаг 2.2] или по 100 мкл для метода размещения [шаг 2.2.1]) путем смешивания меченного Fc белка (10-50 мкг/мл) и флуоресцентного конъюгированного красителем античеловеческого Fc-антитела (соотношение 1 к 3: 30-150 мкг/мл) в фосфатно-солевом буфере (PBS). Затем инкубируйте смесь в течение 30 минут при RT.
- С помощью шприца 22-G введите 25 мкл рекомбинантного белка, приготовленного на предыдущем этапе (2.1), через небольшое отверстие на боковой стороне матрицы (стрелки на рисунках 1А, 1С и 1Е).
- В качестве альтернативы поместите 100 мкл рекомбинантного белка в верхнюю щель матрицы и отсасывайте примерно половину раствора из маленького отверстия (стрелки на рисунках 1А, 1С и 1Е), чтобы рекомбинантный белок оставался в полосатых областях.
- Инкубировать чашку в течение 30 мин при 37 °C в инкубаторе для клеточных культур.
- Поместите 300 мкл PBS в верхнюю щель (рисунок 1B) и сделайте аспирацию из небольшого отверстия, расположенного сбоку матрицы (стрелки на рисунках 1A, C и E), чтобы удалить неприкрепленные рекомбинантные белки. Не отсасывайте PBS полностью, потому что белки высохнут. Повторите этот шаг дважды. (всего 3 раза)
- Осторожно снимите матрицу и немедленно поместите ~100 μл контрольного белка (10-50 μг/мл; Fc), чтобы покрыть всю полосатую область, создав альтернативное покрытие. Затем инкубируйте чашку в течение 30 минут при температуре 37 °C в инкубаторе для клеточных культур.
- После трехкратного мытья поверхности посуды PBS обваляйте ее ~100 мкл 20 мкг/мл ламинина в PBS.
заметка: Ламинин следует размораживать на льду, чтобы не допустить застывания.
- Инкубируйте чашку в течение 1 ч при 37 °C в инкубаторе для клеточных культур.
- Трижды вымойте поверхность посуды PBS и добавьте питательную среду. Поместите покрытую покрытием форму с питательной средой в инкубатор с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C до использования.
3. Культивирование нейронов гиппокампа из эмбрионов мышей E15.5
- Усыпьте мать через вывих шейки матки и изолируйте три эмбриона E15.5.
- Разрежьте ножницами кожу и череп сагиттально по средней линии головы, а мозг удалите с помощью маленькой ложечки. Осторожно перенесите мозг в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую 3 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS).
- С помощью скальпеля вырежьте полушария, включая кору, гиппокамп и полосатое тело (рисунок 2A). Затем рассеките область гиппокампа, осторожно удалив мозговые оболочки, и перенесите рассеченные ткани гиппокампа в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 2 мл раствора HBSS, на лед (рис. 2B-C). Соберите в пробирку 6 гиппокампов из 3 эмбрионов, которых достаточно для культивирования нейронов в 8 чашках.
- Замените раствор HBSS раствором трипсина/этилендиамина тетрауксусной кислоты (трипсин/ЭДТА) (2 мл) и инкубируйте пробирку при 37 °C в течение 15 минут на водяной бане.
заметка: Аспиратуйте HBSS без центрифугирования и не сцеживайте раствор HBSS, наклоняя пробирку.
- Нейтрализуйте активность трипсина, добавив 500 мкл фетальной бычьей сыворотки (FBS).
- Центрифугируйте смесь при 100 х г в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и промойте гранулу 2 мл питательной среды. Повторите этот шаг еще раз.
- Пипетируйте гиппокамп вверх и вниз 10 раз в культуральной среде, используя наконечник объемом 1000 мкл с большим отверстием (разрезом) для диссоциации ткани.
- Замените на обычный (неразрезанный) наконечник объемом 1000 мкл и пипетируйте диссоциированную ткань вверх и вниз, чтобы получить одноклеточную суспензию.
- Разделите отдельные ячейки, пропустив их через сетчатое сетчатое фильтр толщиной 80-100 мкм.
- Центрифугируйте отфильтрованную одноклеточную суспензию при давлении 150 x g в течение 5 минут.
- Удалите надосадочную жидкость путем аспирации и ресуспендируйте гранулу (нейроны) в 2 мл питательной среды.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра с окрашиванием трипановым синим, чтобы определить плотность и жизнеспособность. Затем поместите 10 000 нейронов в 150 мкл питательной среды для каждого набора полосок. Суспензия должна быть аккуратно размещена, чтобы покрыть всю область полосы.
