Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Проведение повторной индукции черепно-мозговой травмы (ЧМТ)
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры TBI скорректированы по сравнению с предыдущими отчетами, в которых воздействие TBI было показано один раз. Протокол здесь применяет тот же параметр, за исключением увеличения общего числа воздействия до 10.
- Оборудование TBI
- Используйте специально изготовленное портативное устройство для введения ЧМТ с закрытым черепом (Рисунок 1A) на головку мыши с правой стороны, как показано на Рисунке 1B.
- Подготовка перед операцией
- Оборудование для автоклавной хирургии, включая обычные ножницы, хирургический суппорт, хирургические пружинные ножницы, хирургические щипцы, щипцы от комаров, наконечники для головы, марлю и аппликаторы с ватными наконечниками.
- Взвесьте и запишите вес тела мыши за 2 ч до операции. Чтобы свести к минимуму отек мозга во время имплантации черепного окна, введите дексаметазона фосфат натрия в дозе 4,8 мг/кг [2 мг/мл, обычно ~70 мкл (необходимо вводить в двух местах)] в четырехглавую мышцу с помощью инсулинового шприца. После инъекции дексаметазона, но до начала операции по лечению ЧМТ, подготовьте стеклянные окна, как указано в шаге 2.1, для последующего использования.
- Продезинфицируйте операционный этап и оборудование для ЧМТ с использованием 75% этанола. Разверните одноразовую стерильную хирургическую простыню, чтобы покрыть операционный этап на стереотаксической платформе. Включите нагревательный прибор и монитор температуры, установив целевую температуру на 37 °C.
- Откройте клапан кислородного баллона и отрегулируйте поток кислорода до 1,5 л/мин. Откройте наркозный аппарат и установите значение уровня изофлурана на 3,<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: 100% чистый кислород может помочь животному пережить удары ЧМТ.
- Поместите мышь в индукционную камеру и оставьте на 5 минут для достижения полной анестезии.
- Как только мышь будет полностью обезболена (т.е. медленная, но стабильная частота дыхания примерно один цикл в 2 с в сочетании с отсутствием рефлекса защемления хвоста), извлеките мышь из индукционной камеры и поместите головку мыши в стереотаксическую рамку.
- Поместите носовой конус с анестезиологической трубкой на морду мыши.
- Поддерживайте анестезию с использованием 1,5% изофлурана, смешанного со 100% чистым кислородом, со скоростью потока 1 л/мин до конца операции. Периодически проверяйте частоту дыхания и выполняйте щипку хвоста или пальца ноги не реже одного раза в 15 минут на протяжении всей операции, чтобы оценить подходящую анестезию. Отрегулируйте концентрацию изофлурана по мере необходимости, чтобы поддерживать желаемую глубину анестезии.
- Хирургия ЧМТ
- Ввести бупренорфин (1 мг/кг, подкожно) с помощью одноразовых инсулиновых шприцев и нанести офтальмоглазную мазь на глаза мыши.
- Удалите волосы с макушки, подстригая их ножницами 1, а затем нанесите средство для депиляции на 1 мин.<бр/>
ВНИМАНИЕ: Не наносите средство для депиляции более чем на 3 минуты на кожу головы, так как оно является раздражителем кожи. Кроме того, избегайте попадания средства для депиляции в глаза мыши.
- Очистите кожу головы, наложив марлю и аппликаторы с ватным наконечником. Затем продезинфицируйте кожу, используя сначала 75% этанола, а затем бетадин. Повторите это три раза (т.е. этанол с последующим бетадином), оставив окончательное нанесение бетадина на кожу.
- Повторно проверьте глубину анестезии, чтобы убедиться, что мышь полностью обезболена (т. е. медленная, но стабильная частота дыхания примерно один цикл в 2 с в сочетании с отсутствием рефлекса щипкового рефлекса). Наложите на кожу хирургические щипцы 3 и сделайте разрез по средней линии длиной 12-15 мм, начиная примерно на 3 мм позади глаз.
- Иссеките кожу над левым и правым полушарием черепа с помощью пружинных ножниц 2.
- Как только череп обнажится, удалите надкостницу, аккуратно потерев ее стерильным аппликатором с ватным наконечником и промыв стерильным физиологическим раствором.
- Визуально осмотрите состояние черепа, чтобы убедиться, что он цел, за исключением двух небольших отверстий, которые были сделаны для предыдущей операции по введению вируса.
- Высушите область черепа и отметьте место удара ЧМТ в следующих координатах: 2,5 мм позади брегмы и 2 мм латерально от сагиттального шва справа (рис. 1В).
- Быстро извлеките мышь из стереотаксической рамки и поместите голову на буферную подушку под устройством TBI.
- Совместите наконечник ударного элемента с отмеченным местом удара.
- Поднимите металлическую колонну, потянув за привязанную нейлоновую нить на 15 см над головой мыши, а затем отпустите ее, позволив грузу свободно упасть на стержень датчика, который соприкасается с верхней частью черепа в месте ЧМТ. Не прикасайтесь к головке мыши при нанесении удара ЧМТ.
- Переместите мышь на нагревательное одеяло и положите его на спину, контролируя состояние дыхания.
- Как только мышь встанет из положения лежа на спине, поместите ее в индукционную камеру изофлурана на ~5 минут с 3% изофлураном, смешанным со 100% чистым кислородом со скоростью потока 1,5 л/мин.
- После того, как мышь будет полностью успокоена (т.е. медленная, но устойчивая частота дыхания примерно один цикл в 2 с, в сочетании с отсутствием рефлекса сжатия хвоста), повторите шаги 1.3.9-1.3.14, чтобы получить в общей сложности 10 ударов.
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем исследовании было обнаружено, что десять воздействий ЧМТ индуцируют устойчивый фенотип с низкой смертностью мышей (данные еще не опубликованы). Параметры могут быть скорректированы для достижения различной степени тяжести черепно-мозговой травмы путем увеличения или уменьшения количества ударов и/или высоты, с которой сбрасывается груз. Все параметры подлежат утверждению местным IACUC.
- Осмотрите череп под хирургическим микроскопом и удалите мышь из исследования, если произошел перелом черепа.
- При фиктивной хирургии следуйте тем же процедурам, которые описаны выше, включая помещение животного под импактор, но без нанесения ударов ЧМТ.
- После того, как мышь выровняется из положения лежа на спине после 10-го удара ЧМТ, поместите ее в индукционную камеру изофлурана на ~5 минут. Затем выполните шаги 1.2.6-1.2.8, чтобы поместить головку мыши на стереотаксическую рамку для операции по имплантации краниального окна, описанной ниже.
