Методическая статья

Флуоресцентное иммуноокрашивание нейронов гиппокампа крыс в микрофлюидном чипе

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Nagendran, T., et al., Использование предварительно собранных пластиковых микрофлюидных чипов для разделения первичных нейронов мышей. J. Vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует иммунофлуоресцентное окрашивание нейронов гиппокампа крысы, культивируемых в микрофлюидном чипе, для анализа созревания нейронов и связей.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Флуоресцентное иммуноокрашивание внутри чипа

  1. Приготовьте 4% раствор фиксации формальдегида в PBS (4% формальдегид, 1 мкМ MgCl2, 0,1 мкм CaCl2, 120 мМ сахароза)
  2. Удалите большую часть сред в лунках чипа (не сушите внутренние отсеки).
  3. Немедленно добавьте 100 мкл фиксирующего раствора в верхние лунки аксонального и соматического отделов.
  4. Через 1 мин добавьте в донные лунки 100 мкл раствора фиксации. Зафиксируйте на 30 минут при комнатной температуре.
  5. Удалите большую часть раствора из лунок от скола (не сушите внутренние отсеки). Немедленно добавьте по 150 мкл PBS в каждую из верхних лунок аксонального и соматического отделов. Подождите 2 минуты, пока ПБС потечет в донные лунки.
  6. Повторите шаг 1,5 дважды.
  7. Удалите большую часть PBS из лунок чипа. Немедленно добавьте 150 мкл PBS с 0,25% TritonX-100 в каждую из верхних лунок аксонального и соматического отделов. Подождите 15 минут.
  8. Удалите большую часть жидкости из лунок чипа и немедленно добавьте по 150 мкл блокирующего раствора (10% нормальной козьей сыворотки в PBS) в каждую из верхних лунок аксонального и соматического компартментов. Подождите 15 мин.<бр/> заметка: Эффективные блокирующие растворы должны быть специфичными для вторичного антитела, например, для вторичного антитела осла против овец используйте сыворотку осла в блокирующем растворе.
  9. Удалите большую часть жидкости из лунок чипа и немедленно добавьте 100 мкл первичного антитела (или антител) в 1% нормальной сыворотке крови коз в PBS в каждую из верхних лунок аксонального и соматического компартментов. Накройте крышкой, чтобы свести к минимуму испарение, и подождите 1 час при комнатной температуре или 4 °C в течение ночи.
  10. Удалите большую часть раствора из лунок от скола (не сушите внутренние отсеки). Немедленно добавьте по 150 мкл PBS в каждую из верхних лунок аксонального и соматического отделов. Подождите 5 минут, пока ПБС потечет в придонные скважины.
  11. Повторите шаг 1.10 дважды.
  12. Удалите большую часть жидкости из лунок чипа и немедленно добавьте 100 мкл вторичного антитела (или антител) в PBS в каждую из верхних лунок аксонального и соматического компартментов. Накройте крышкой, чтобы свести к минимуму испарение, и подождите 1 час при комнатной температуре.
    заметка: Обратитесь к инструкциям производителя для рекомендуемого разведения вторичных антител.
  13. Повторите шаги 1.10-1.11.
  14. При визуализации в течение 1 дня после иммуноокрашивания держите чип заполненным PBS. Если чип будет храниться дольше 1 дня перед визуализацией, заверните чашку с чипом в парафиновую пленку, чтобы предотвратить испарение, и храните ее при температуре 4 °C до тех пор, пока она не будет готова к изображению.
  15. Для более длительного хранения образцов можно использовать монтажные среды (например, Fluoromount-G).
    1. Удалите большую часть жидкости из лунок чипа. С помощью одноразовой пластиковой пипетки объемом 1 мл добавьте по 2 капли монтажной среды в каждую из верхних лунок аксонального и соматического отделов.
    2. Наклоните микросхему, чтобы стимулировать поток монтажной среды по каналам. Через 5 минут добавьте 2 капли в донные лунки. Подождите 1 час перед созданием образа.
      заметка: После использования монтажного носителя повторное зондирование других целей будет невозможно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
КсонаЧипXona Microfluidics, LLCХК150Барьер из микроканавок длиной 150 мкм
КсонаЧипXona Microfluidics, LLCМодель XC450Барьер из микроканавок длиной 450 мкм
КсонаЧипXona Microfluidics, LLCМодель XC900Барьер для микроканавок длиной 900 μм
Предварительное покрытие XCXona Microfluidics, LLCПредварительное покрытие XCвходит в комплект XonaChips
XonaPDLXona Microfluidics, LLCXonaPDL
Нейробазальная средаThermoFisher Scientific21103049
Стеклянные пастеровские пипеткиСигма-ОлдричCLS7095D5X СИГМА
Прокол 16% формальдегидаThermoFisher ScientificNo 28906
ПБС (10 шт.)ThermoFisher ScientificQVC0508
Обычная козья сывороткаThermoFisher Scientific16210064
Тритон Х-100ThermoFisher ScientificNo 28314
Антитела против vGlut1НейроМаб75-066клон N28/9, 1:100
Вторичные антитела Alexa FluorThermoFisher Scientific17:40
Система конфокальной визуализации с вращающимся дискомТехнология AndorCSU-X1, iXon X3 EMCCD60x силиконовое масло и 20x объективы

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Triton X 100PBS

Похожие статьи