1. Флуоресцентное мечение и иммуноцитохимия
Примечание: Иммунофлуоресцентное мечение первичных культур клеток коры головного мозга проводилось в чашках для клеточных культур со стеклянным дном 35 мм рабочим объемом 1 мл.
- Дважды вымойте посуду со стеклянным дном с буферизованным фосфатами физиологическим раствором pH 7,4 (PBS).
- Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом на 15 минут при комнатной температуре (ОТ).
- Дважды промойте клетки PBS и пропитайте 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 5 минут.
- Обрабатывайте клетки в течение 20 мин в ЛТ F(нитевидным)-актин-специфическим красителем, AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40, 25 мкл фаллоидина в 1 мл PBS).
- Дважды промойте клетки PBS и заблокируйте 10% нормальной козьей сывороткой в режиме RT на 1-2 часа.
- Разведите куриное поликлональное антитело к MAP2 (микротрубочкам-ассоциированному белку 2) (1:2500) в PBS с 2% нормальной козьей сывороткой и инкубируйте O/N (в течение ночи) при 40 °C.
- После инкубации дважды промыть в PBS.
- Разведите вторичное антитело (Alexa Red 594-конъюгированный козий антикуриный IgG (1:500) с 2% нормальной козьей сывороткой и инкубируйте в течение 2 часов при ЛТ.
- Промойте PBS и добавьте 10 μл/чашку красителя Hoescht.
- Инкубировать в течение 3 минут при RT и дважды промыть PBS.
заметка: Теперь помеченные клетки готовы к шагу 2 (подсчет F-актина в точках).
- Законсервируйте образец клетки 100 мкл реагента против выцветания в качестве покровного средства и храните его при температуре 4 0°C в темноте для длительного хранения.
заметка: Фаллоидин относительно стабилен в PBS при +4 °C в темноте в течение 1 недели, а флуоресценцию можно сохранить с помощью реагентов, препятствующих выцветанию. Однако оптимальные снимки получаются через 1-3 дня после окрашивания, так как при длительном хранении фаллоидин может начать диффундировать.
2. F-актин Подсчет точек
- Включите флуоресцентный микроскоп и переключитесь в положение объектива 20×. Откройте программное обеспечение микроскопа и настройте программу на размер изображения 1280×960 пикселей и разрешение изображения 0,17 мкм/пиксель при масштабе 1×.
- Получение изображений совместно меченых F-актин/MAP2 нейронов под зелеными (495 нм) или красными (613 нм) флуоресцентными каналами.
- Выберите 5 зеленых (F-актин)/красных (MAP2) иммуномеченых/синих (Hoescht) флуоресцентных изображений отдельных нейронов с четко очерченными дендритными пучками.
- Идентификация богатых F-актином структур в дендритном сегменте второго порядка (диапазон длины 25-75 мкм) с помощью непрерывной иммунофлуоресценции MAP2.
- Поверните выбранную область изображений до горизонтального уровня. Скопируйте и вставьте как новое изображение.
- Вычтите фон изображений, используя последовательную корректировку для каждого блюда.
- Подсчитайте ярко-зеленый F-актин в точках и проведите по длине выбранного дендритного сегмента вручную обученными независимыми наблюдателями. Экспортируйте данные в файл электронной таблицы.
- Рассчитайте плотность, разделив общее количество F-актина, меченного пунктами (N), на длину (L) меченых MAP2 дендритов. Выразите данные как количество F-актина пунктира на 10 мкм дендрита
заметка: В каждый выбранный дендритный сегмент включали точки (размером ≤1,5 мкм) флуоресценции F-актина с пиковой интенсивностью не менее чем на 50% выше средней интенсивности окрашивания в дендритном стволе.
