$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Животные
- В этом исследовании используются самцы и самки крыс в возрасте 3 месяцев.
- Держите животных в 12-часовом цикле свет/темнота со свободным доступом к еде и воде.
2. Приготовление коктейля KAX (кетамин + ксилазин + ацепромазин) для анестезии животных
- Растворите 50 мг ксилазина (20 мг/мл) в 5 мл кетамина (100 мг/мл) с 1 мл ацепромазина (10 мг/мл) и 3 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешиваем.
- Простерилизовать с помощью шприца-фильтра и хранить этот раствор во флаконе с сывороткой объемом 10 мл.
3. Впрыск KAX
- Взвесьте животное (г) и верните в клетку до готовности к инъекции.
- Введите 0,1 мл KAX/100 г массы тела животного внутрибрюшинно, используя инсулиновый шприц объемом 1 мл с иглой 28 G.
- Позвольте животному потерять сознание. Проверьте рефлексы, щипнув лапы и хвост.
- Держите всех животных в безопасности в лаборатории на время операции.
- После операции пересадите животных в клетки и поддерживайте комфорт при комнатной температуре (ЛТ) до тех пор, пока не придет в сознание. Возвращайте животных в помещение для животных только тогда, когда животные проснутся и вернутся к нормальному поведению.
4. Подготовка к операции и сборка микроигл
- Сделайте стерильный 2 М раствор NaCl.
- С помощью съемника микроэлектродов (Рисунок 1C) протяните одну толстую стандартную полированную и тонкостенную боросиликатную трубку внутреннего диаметра 0,86 мм в две мелкоконические стеклянные микроиглы (Рисунок 1D, Рисунок 1E).
- Заполните одну микроиглу с предыдущего этапа физиологическим раствором 2 М с помощью иглы для обратной засыпки шприца и шприца объемом 1 мл (рис. 1B). Выдавите пузырьки воздуха с кончика электрода.
- Наполните второй шприц объемом 1 мл 2 М NaCl. Подсоедините иглу 18 G, а затем прикрепите полиэтиленовую трубку длиной (примерно 10 дюймов) (рисунок 1A). С помощью поршня шприца заполните полиэтиленовую трубку физиологическим раствором через иглу.
- Когда микроигла и трубка будут заполнены физиологическим раствором, осторожно соедините их. Удалите воздух из соединения между ними (рисунок 2).
- Тонко скосите кончик микроиглы, очень слегка соскоблив его с волокнами бумажного полотенца.
- Проверьте сопротивление микроиглы, осторожно нажимая на поршень шприца до тех пор, пока на бумажном полотенце не будет видна тонкая струя жидкости. Струя жидкости должна быть не шире 0,5 мм.
5. Подготовка животного
- Нанесите 1 - 2 капли местного анестетика на роговицу (Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP, 0,5%). Подождите, пока глазной рефлекс не исчезнет.
- Подстригите усы ножницами.
- Пропитайте ватный аппликатор раствором бетадина и смойте область вокруг экспериментального глаза.
- С помощью микроскопа приложите кровоостанавливающее средство, чтобы зажать нижнее веко, чтобы выпячить глаз, обнажить эписклеральную вену и ограничить движение глаз. (Рисунок 3, стрелка)
6. Инъекции физиологического раствора, вызывающие глаукому
- Когда микроигольчатая сборка и животное подготовлены, начинают делать инъекции.
- Когда подтвердится, что животное не реагирует на щипание ног/хвоста, осторожно проколите эписклеральную вену микроиглой, подходя к вене под низким углом от 10 до 20 градусов (Рисунок 3, белая стрелка). Успешный прокол в вену становится очевидным, когда кровь попадает на кончик микроиглы (Рисунок 3, черная стрелка).
- Медленно и вручную введите в вену примерно 50 мкл физиологического раствора. Это должно занять примерно 10 секунд. Вены будут бледнеть белым цветом по мере циркуляции соли по сосудистой сети (Рисунок 4, стреловидный наконечник). Некоторые регионы могут иметь кроваво-красный цвет (Рисунок 4, стрелка).
- Выполните вторую инъекцию в вену, противоположную месту первой, чтобы обеспечить полное повреждение сетчатки всего слоя ганглиозных клеток сетчатки.
Примечание: В течение нескольких минут вы должны увидеть отчетливый мутный вид через радужную оболочку глаза, поскольку соль циркулирует по сосудистой системе.
- Оставьте противоположный глаз необработанным для использования в качестве внутреннего контроля.
