Выделение амилоидных фибрилл из экстракта мозговой ткани

Аннотация

Источник: Upadhyay, A. et al., Биохимическая очистка и протеомная характеристика амилоидных фибрилловых ядер мозга. J. Vis. Exp. (2022)

Это видео демонстрирует протокол выделения амилоидных фибрилл из экстракта ткани мозга мыши с использованием центрифугирования градиента плотности и расщепления неамилоидных белков.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Забор тканей и очистка амилоида

ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале амилоидные фибриллы должны быть выделены из только что препарированных областей мозга. Тем не менее, этот метод также хорошо работает с мгновенно замороженными или мгновенно замороженными тканями мозга. Ниже приведен краткий обзор тканей мозга для мгновенной заморозки для хранения и использования в последующее время.

1. Сбор и хранение мозговой ткани: Препарируйте мозг мыши и быстро соберите области, насыщенные амилоидом (т.е. кору и гиппокамп), с последующим мгновенным замораживанием в жидком азоте или спиртовой ванне с сухим льдом><. заметка: Мгновенная заморозка помогает сохранить структурные характеристики составляющих ткани. Мышей усыпляют изофлураном и шейным вывихом. Рекомендуется избегать использования CO₂, так как это может нарушить целостность протеома мозга.
2. После диссекции разрежьте и храните свежие ткани небольшими блоками (например, 5 мм x 5 мм), так как это способствует более эффективной гомогенизации перед экстракцией амилоида. Перенесите ткань в стерильный криогенный флакон, затяните его крышку и быстро погрузите.
3. Храните ткани замороженными в ультрахолодных условиях (т.е. при температуре -80 °C или жидком азоте). Если экстракция должна быть выполнена через несколько дней, храните ткани при температуре -20 °C и избегайте циклов замораживания и размораживания. Разморозьте замороженные ткани на влажном льду, когда они будут готовы к извлечению и очистке.
   заметка: Прямой контакт тканей с жидким азотом может привести к повреждению тканей и белков. Обратите внимание, что спиртовая ванна может удалить стойкие маркеры с этикеток тюбиков.

2. Обогащение нерастворимого материала додецилсульфата натрия (SDS)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все шаги на льду и центрифуге при 4 °C, если не указано иное. Производители и каталожные номера химических реагентов и приборов приведены в Таблице материалов.

1. Начните с только что рассеченных или замороженных участков мозговой ткани (размороженных на льду), помещенных в пробирку объемом 2 мл, содержащую 6-8 керамических шариков и свежеприготовленный ледяной гомогенизационный буфер (1 мл на 0,25-1 г влажной тканевой массы).
2. Перенесите трубки в гомогенизатор бисерной мельницы и измельчите содержимое ткани со скоростью 4000 об/мин с двумя циклами по 30 с каждый и интервалом 30 с между ними.
   заметка: В качестве альтернативы для измельчения и гомогенизации тканей можно использовать моторизованные мешалки или гомогенизаторы.
3. Добавьте 9 мл ледяного гомогенизационного буфера к 1 мл гомогената цельной ткани мозга в пробирках объемом 15 мл, запечатайте полосками из лабораторной восковой пленки и вращайте из конца в конец в течение ночи при температуре 4 °C для обеспечения надежной солюбилизации.
   заметка: Чтобы удалить нежелательный крупный клеточный мусор и липиды, на следующее утро вращайте пробирки при температуре 800 x g при 4 °C в течение 10 минут и соберите надосадочную жидкость в свежую пробирку. Суспендируйте оставшуюся гранулу в 2 мл ледяного гомогенизационного буфера, хорошо перемешайте, снова отверните в течение 10 минут при температуре 4 °C и соедините две надосадочные жидкости.
4. Медленно добавьте твердую сахарозу в суспензию тканевого экстракта до конечной концентрации 1,2 М, хорошо перемешайте и центрифугируйте при 250 000 x g в течение 45 минут при 4 °C.
5. Осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки. Ресуспендировать гранулу в 2 мл гомогенизационного буфера, содержащего 1,9 М сахарозы, путем тритуирования, с последующим центрифугированием при 125 000 x g в течение 45 мин при 4 °C.
   заметка: Объем буфера можно регулировать в зависимости от количества материала, полученного на предыдущем этапе. Как правило, 10 объемов гомогенизационного буфера (V/V) идеально подходят для этого этапа.
6. Соберите верхний белый твердый слой с помощью пипетки, переложите его в свежую пробирку и растворите в 1 мл ледяного буфера для промывки, пипетируя вверх и вниз несколько раз, не вводя пузырьков воздуха.
7. Помимо верхнего слоя, гранула также обогащена амилоидными фибриллами. Для получения более высокого выхода соедините две фракции и продолжайте. Аккуратно удалите средний водный слой с помощью пипетки и выбросьте.
8. Центрифугируйте объединенные фракции при 8000 x g в течение 20 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
9. Добавьте 1 мл ледяного буфера для разложения в промытую гранулу, восстановите и инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 3 часов.
10. Центрифугируйте при давлении 8000 x g в течение 20 мин при 4 °C и удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
11. Повторно суспензируйте и промойте (так же, как Шаг 2.8.) переваренную гранулу два раза в 1 мл ледяного буфера Tris.
12. Ресуспендируйте промытую гранулу в 1 мл солюбилизационного буфера, содержащего 1% SDS и 1,3 М сахарозы, путем пипетирования вверх и вниз. Быстро центрифугируйте при 200 000 x g в течение 60 мин при 4 °C.
    заметка: Несмотря на то, что амилоидные фибриллы обладают высокой устойчивостью к детергентам и денатурантам, очень длительное воздействие детергента (1% SDS) может повлиять на целостность фибрилл или удалить плотно связанные белки, что поставит под угрозу последующие анализы. Поэтому сразу после суспензии гранул приступают к центрифугированию.
13. Сохраните гранулу и увеличьте объем оставшейся надосадочной жидкости, добавив 50 мМ трис-буфера (в соотношении 1:0,3) для снижения концентрации сахарозы с 1,3 до 1 М и центрифугируйте еще раз при 200 000 х г в течение 45 мин при 4 °С.
14. Растворите две гранулы в 100 μл трис-буфера, содержащего 0,5% SDS, и бассейн для очистки амилоида. Видимые гранулы маленькие и должны казаться непрозрачными и не совсем белыми (см. рисунок 1A).

Результаты

Рисунок 1: Подтверждение экстракции амилоида с помощью биохимического окрашивания и визуализации амилоидных фибрилл. (A) Обогащенная амилоидсодержащая нерастворимая гранула SDS имеет непрозрачный кремово-белый цвет. (B) окрашивание в конголезный красный цвет растворимой надосадочной жидкости SDS и нерастворимой гранулы SDS, содержащей очищенный амилоид, нанесенной на...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ингибиторная протеаза	Термо Сайентиал	164535	Можно использовать альтернативные инструменты, химические вещества и антитела других производителей
Хлорид кальция	Сигма-Олдрич	С1016	Можно использовать альтернативные инструменты, химические вещества и антитела других производителей
Коллагеназа	Сигма-Олдрич	С0130	Можно использовать альтернативные инструменты, химические вещества и антитела других производителей
Полный коктейль ингибиторов протеазы	Сигма-Олдрич	11697498001	Можно использовать альтернативные инструменты, химические вещества и антитела других производителей
Днасе I	Thermo Fisher Scientific	ЕН0521	Можно использовать альтернативные инструменты, химические вещества и антитела других производителей
K54 Двигатель системы гомогенизации тканей	Коул Пармер	Глас-Кол 099С	Можно использовать альтернативные инструменты, химические вещества и антитела других производителей
Ультрацентрифуга Optima L-90K	Бекман Коултер	БР-8101П-Э	Можно использовать альтернативные инструменты, химические вещества и антитела других производителей
Гомогенизатор тканей Precellys 24	Инструменты Бертена	P000062-ПЭВО0-А	Можно использовать альтернативные инструменты, химические вещества и антитела других производителей
Додецилсульфат натрия (SDS)	Сигма-Олдрич	74255	Можно использовать альтернативные инструменты, химические вещества и антитела других производителей
Микроцентрифуга Sorvall Legend Micro 21R	Thermo Fisher Scientific	75002446	Можно использовать альтернативные инструменты, химические вещества и антитела других производителей
Трис-HCl	Thermo Fisher Scientific	15568025	Можно использовать альтернативные инструменты, химические вещества и антитела других производителей