Внутримозговая инъекция для анализа распределения цитомегаловируса мышей в мозге новорожденной мыши

Аннотация

Источник: Kawasaki, H., et al. Внутримозговое и внутрисосудистое введение вирусных частиц и флуоресцентных микрогранул в неонатальный мозг. J. Vis. Exp. (2016).

Это видео демонстрирует процесс внутримозговой инъекции для изучения распределения цитомегаловируса мышей (MCMV) в мозге неонатальной мыши. MCMV, разработанный для экспрессии усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) для обеспечения видимости, вводится в боковой желудочек мозга мышиного щенка. Введенный вирус циркулирует по спинномозговой жидкости, инфицируя клетки в перивентрикулярной области, включая маргинальную зону, сосудистое сплетение и субвентрикулярную зону.

Протокол

1. Инъекция ICV MCMV и флуоресцентных микрогранул неонатальным мышам

1. Поддерживайте нормальную беременность мышей ICR в помещении с регулируемой температурой в течение 12-часового цикла свет/темнота. В день рождения новорожденным присваивается уровень P 0,5.
2. Стерилизуйте шприц объемом 10 мкл и иглу 27 г 70% спиртом.
3. Загрузите в иглу раствор для инъекций (5 мкл), содержащий MCMV или флуоресцентные микрогранулы, осторожно потянув за поршень шприца.
4. Удерживайте новорожденную мышь (P 0,5), положив мышь на лед на 3 - 4 минуты. После того, как животное попадет под наркоз, используйте метод реакции «щипки пальца ноги», чтобы определить глубину анестезии.
5. Отметьте место инъекции нетоксичной лабораторной ручкой на расстоянии примерно 0,7 - 1,0 мм латерально от сагиттального шва и 0,7 - 1,0 мм каудально от неонатальной брегмы (рис. 1А).
6. Введите иглу на глубину 2 мм, перпендикулярно поверхности черепа в отмеченном месте инъекции. Для справки отметьте 2 мм от кончика иглы нетоксичным мейкером.
7. Медленно введите 5 μл MCMV (примерно 5 ×^{10 5} PFU) в боковой желудочек, не открывая волосистую часть головы (рис. 1B).
8. Другой группе мышей вводили раствор объемом 5 мкл, содержащий флуоресцентные микрогранулы (0,1 - 0,3 мкм, примерно 5,75 × 10⁸ частиц) тем же методом.
9. Медленно извлеките иглу через 10 - 20 секунд после прекращения движения поршня, чтобы предотвратить обратный поток.
10. Чтобы восстановиться, держите мышей в течение 5-10 минут в теплом контейнере до тех пор, пока не восстановятся движения и общая реакция.
11. Соберите мозг в различные моменты времени (3, 12, 24, 48 и 72 часа) после инъекции.

Результаты

Рисунок 1: Места инъекций неонатальной мыши. (А, Б) Инъекция ICV 5 мкл MCMV (примерно 5 × 10⁵ PUE) или 5 мкл микрогранул (примерно 5,75 × 10⁹ частиц). (А) Место инъекции находится посередине между ухом и глазом (в месте примерно на 0,7 - 1,0 мм латеральнее сагиттального шва и на 0,7 - 1,0 мм каудально от неонатальной брегмы). (B) Игла 27 G со шп...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
SPHERO ТМ Пенополистирол Нильский Красный 0.04-0.06	Spherotech, Inc.	ФП-00556-2
SPHERO ТМ Пенополистирол нильский красный 0,1-0,3	Spherotech, Inc.	ФП-0256-2
SPHERO ТМ Пенополистирол флуоресцентный нильский красный 1.7-2.2	Сферотек, инк.	ФП-2056-2
10% сыворотка мыши	ДАКО	Х0910
Мышь C57BL/6	SLC, Inc.
Мышь ICR	SLC, Inc.
Модифицированные микролитровые шприцы (серия 7000)	Компания Гамильтон
Игла 35 калибра	Сайто Медикал
Вектор pEGFP-N1	Клонтех	#6085-1