Оценка интернейронного ответа на хемопривлекательные сигналы от перивентрикулярных эндотелиальных клеток

Аннотация

Источник: Datta, D., et al. анализы миграции, химиопритяжения и кокультуры эндотелиальных клеток, полученных из стволовых клеток человека, и ГАМКергических нейронов. J. Vis. Exp. (2020).

Это видео показывает метод тестирования миграции интернейронов в ответ на хемопривлекательные сигналы от перивентрикулярных эндотелиальных клеток (PVEC). Интернейроны размещаются в центральном отсеке, с ПВЭК и контрольными клетками по обе стороны. Повышенная миграция к ПВЭК указывает на положительный ответ на их хемопривлекательные сигналы.

Протокол

1. Химио-привлекательный анализ

1. Поместите трехлуночный вкладыш для культуры в центр чашки диаметром 35 мм, покрытой поли-L-орнитином/ламинином, с помощью стерильного пинцета.
2. Переверните блюдо вверх дном. Отметьте границу вокруг среднего отсека вставки с помощью перманентного черного маркера с ультратонким наконечником.
3. Затравка 3 x 10⁴ человеческих ГАМКергических интернейронов в среднем компартменте в 70 мкл нейронной среды (рис. 1А).
4. Семена^{10 4} перивентрикулярных эндотелиальных клеток человека в 70 мкл перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среды и 10⁴ контрольных эндотелиальных клеток в 70 мкл контрольной эндотелиальной клеточной среды в двух наружных компартментах соответственно (рис. 1А).
5. Добавьте 1 мл среды для совместного культивирования (50% перивентрикулярной поддерживающей среды без ГАМК и 50% нейрональной среды) вдоль бортика чашки, чтобы предотвратить высыхание покрытия на чашке.
6. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что элементы не вытекают из отсека для вставки.
7. Инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 °C и 5%_CO2. После 24-часовой инкубации проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки прикреплены правильно и что утечки нет.
8. Через 48 часов после посева аккуратно снимите вставку с помощью стерильного пинцета. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что клеточный слой не нарушен (день 0).
9. Удалите среду и добавьте 1 мл свежей среды для совместной культуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отложите необходимое количество блюд для дня 0 изображений.
10. Инкубируйте клетки в течение 36 ч при 37 °C и 5%_CO2. Через 36 часов аспирируйте среду, зафиксируйте клетки 4% PFA на 10 минут и промойте 3 раза 1x PBS.
11. Окрашивание человеческих ГАМКергических интернейронов античеловеческим β-тубулином или античеловеческим антителом MAP2. В конце процедуры окрашивания добавьте в каждую посуду по 1 мл монтажной среды, препятствующей выцветанию.

2. Визуализация и анализ данных

1. Поместите иммуноокрашенную чашку для анализа под микроскоп при 4-кратном увеличении.
2. Сохраняйте один длинный край прямоугольной границы (выполненный в шаге 5.10 выше) в поле зрения. Сделайте снимки клеток в свободном от клеток пространстве, прилегающем к этой границе. Получение изображений вдоль правого длинного края и левого длинного края прямоугольной границы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, расположенные по диагонали относительно прямоугольника, не учитываются из-за неоднозначности при выборе короткого или длинного края в качестве начального знака. Кроме того, количество клеток, мигрирующих через короткий фронт, часто значительно меньше (возможно, из-за меньшего количества начальных ячеек вдоль короткого края) и не учитывается.
3. Откройте изображения в ImageJ. Рассчитайте расстояние между каждой ячейкой и межевой отметкой с помощью ImageJ.
4. Чтобы оценить миграцию с точки зрения номеров ячеек, задайте конкретное расстояние от границы на полученном изображении в ImageJ. Подсчитайте количество ячеек, которые присутствуют на этом расстоянии. Рассчитать среднее число, стандартное отклонение
5. и статистической значимости с использованием соответствующего программного обеспечения.

Результаты

Рисунок 1: Анализ химиопривлекательности. (А) Схема анализа химиопривлекательности. С помощью трехлуночной культуральной вставки интернейроны (ИН) засеивали в середину (зеленый пунктирный прямоугольник), в то время как перивентрикулярные эндотелиальные клетки (ПВ ЭК; оранжевый пунктирный прямоугольник) и контрольные эндотелиальные клетки (ЭК; желтый пунктирный прямоугольник) засеивали с обеих сторон....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Контроль над эндотелиальными клетками человека	Клеточная динамика	Р1022
Добавка для контроля эндотелиальных клеток	Клеточная динамика	М1019
DMEMF/12 средний	Thermofisher Scientific	11320033
E6 средний	Thermofisher Scientific	A1516401
ФГФ2	Thermofisher Scientific	PHG0261
Фибронектин	Thermofisher Scientific	33016-015 (Английский)
ГАМК	Сигма-Олдрич	А2129
Гемацитометр	Сигма-Олдрич	Z359629
ГАМКергические нейроны человека	Клеточная динамика	Р1013
Основная среда ГАМКергических нейронов человека	Клеточная динамика	М1010
Нейродобавка к ГАМКергическим нейронам человека	Клеточная динамика	М1032
Ламинин	сигма	Л2020
Монтажная среда	Векторные лаборатории	Н-1200
поли-L-орнитин	сигма	стр4957
ПБС	Thermofisher Scientific	14190
ВЭГФ-А	Пепротех	100-20
Полный комплект VascuLife VEGF Medium	Технологии Lifeline Cell	ЛЛ-0003	Компонент контрольной среды эндотелиальных клеток человека
3-луночный силиконовый культуральный вкладыш	Там же	No 80369
Тарелка 35 мм	Корнинг	430165
4% раствор PFA	Научный центр Фишера	AAJ19943K2
Инвертированный фазово-контрастный микроскоп	Цейсс	Zeiss Axiovert 40C
Флуоресцентный микроскоп	Олимп	ФСХ-100
Антитела к β-тубулину человека	Биолегенда	802001
Антитела к MAP2	Нейромика	CH22103