Иммунопреципитация целевых комплексов белок-ДНК из лизата двигательных нейронов

Аннотация

Источник: Montanera, K. N. et al., Rhee, H. S. Картирование взаимодействий белка-ДНК с высоким разрешением в нейронах, полученных из стволовых клеток мыши, с использованием иммунопреципитации-экзонуклеазы хроматина (ChIP-Exo). J. Vis. Exp. (2020)

Это видео демонстрирует иммунопреципитацию фрагментов ДНК, сшитых с белком-мишенью из лизатов моторных нейронов, полученных из стволовых клеток, с использованием магнитных шариков, покрытых специфическими антителами-мишенями.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Автоклавная дистиллированная и деионизированная вода (ddH₂O) рекомендуется для изготовления буферов и реакционных мастер-смесей.

1. Сбор и сшивание клеток

1. После дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши (ES) в постмитотические нейроны добавьте 11% формальдегида к собранным клеткам до конечной концентрации 1% (v/v). Скальные элементы на качающейся платформе (коромысле, вибростенде или ротаторе) в течение 15 мин, при комнатной температуре (RT, 25 °C).
   заметка: В зависимости от целевого белка, подлежащего сшивке, может быть использовано меньшее сшивание формальдегида (например, конечная концентрация 0,5%) или двойное сшивание с дисукцинимидилглутаратом (ДСГ).
2. Добавьте 2,5 М глицина до конечной концентрации 150 мМ, чтобы остановить реакцию сшивания. Скальные ячейки на качающейся платформе в режиме RT, в течение 5 мин.
3. Центрифугирование сшитых клеток в конических пробирках объемом 15 мл в режиме RT в течение 6 мин при давлении 1350 x g. Отсадите раствор, затем ресуспендируйте клетки в 5 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS).
   заметка: Гранулы сшитых ячеек могут храниться при температуре -80 °C после мгновенной заморозки жидким азотом.

2. Лизис клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги в этом протоколе относятся примерно к 2 x 10⁷ нейронным клеткам, дифференцированным от мышиных ES-клеток. Для разрушения открытых клеток будут использоваться буферы для лизиса, содержащие различные моющие средства. Добавьте 50 мкл 1000-кратного полного ингибитора протеазы (CPI) в 50 мл буфера непосредственно перед использованием.

1. Приготовьте буферы для лизиса 1−3, как описано в таблице 1.
2. Разморозьте сшитые клеточные гранулы на льду, затем тщательно ресуспендируйте клеточные гранулы в 3 мл буфера для лизиса 1 на 15 мл конических пробирок. Покачивайтесь при температуре 4 °C в течение 15 минут на качающейся платформе. Центрифугировать при давлении 1 350 x g в течение 5 мин при 4 °C и отсадить надосадочную жидкость.
3. Тщательно ресуспендируйте гранулированные клетки в 3 мл лизисного буфера 2. Покачивайтесь при температуре 4 °C в течение 10 минут на качающейся платформе. Центрифугировать при давлении 1 350 x g в течение 5 мин при 4 °C и отсадить надосадочную жидкость.
4. Добавьте 1 мл лизисного буфера 3 в каждую гранулу, затем держите на льду. Сразу приступайте к ультразвуковой обработке.

3. Ультразвуковой хроматин

ПРИМЕЧАНИЕ: Держите образцы на льду или при температуре 4 °C во время этой процедуры ультразвука, чтобы уменьшить обратное сшивывание.

1. С помощью стерильного шпателя добавьте ультразвуковые шарики (Таблица материалов) до градуировочной отметки 0,2 мл на полистирольные пробирки объемом 15 мл. Промыть ультразвуковые шарики путем вортексирования в 600 мкл 1x PBS до тех пор, пока не останутся сухие пятна. Центрифугируйте пробирки в течение 5 с при 30 x g и отбирайте 1x PBS.
   заметка: Ультразвуковая обработка в полистирольных трубках более эффективна, чем ультразвуковая обработка в полипропиленовых трубках. Если обрабатывается меньшее количество клеток (например, <10⁶ клеток), используйте полистирольные трубки объемом 1,5 мл без добавления ультразвуковых шариков.
2. Тщательно суспендируйте ядерные лизаты в 1 мл буфера для лизиса 3 (начиная с шага 2.4), затем перенесите в полистирольные пробирки объемом 15 мл, содержащие ультразвуковые шарики. Кратковременно проделайте вихревые трубки из полистирола.
3. Чтобы фрагментировать сшитую хроматиновую ДНК, облучайте ядерные лизаты ультразвуком при температуре 4 °C в течение оптимизированного числа циклов, с амплитудой мощности 30 Вт и циклами ультразвука 30 с вкл/30 с выкл.
   заметка: Оптимизация ультразвуковой обработки для каждого типа клеток и партии приведет к наилучшему выходу иммунопреципитации-экзонуклеазы хроматина (ChIP-exo). Для 2 x 10⁷ нейрональных клеток мыши 20−30 циклов ультразвуковой обработки при указанных настройках будут фрагментировать хроматин в диапазоне 100−500.о.
4. После завершения ультразвуковой обработки перенесите всю надосадочную жидкость (ультразвуковые лизаты) из каждого образца в пробирки объемом 1,5 мл. Добавьте 10% 2-[4-(2,4,4-триметилпентан-2-ил)фенокси]этанол) в каждый образец в конечной концентрации 1%. Перемешайте с помощью пипетки.
5. Для обработки остатков гранулированных клеток центрифугируйте образцы при давлении 13 500 x g в течение 10 мин при 4 °C. Перенесите все лизаты (надосадочную жидкость) с ультразвуком из каждого образца в новые пробирки объемом 1,5 мл.
6. Возьмите 30 мкл ультразвукового лизата из каждого образца (~3% ультразвукового лизата) и добавьте в новые пробирки объемом 1,5 мл для проверки ультразвуковой обработки. Храните оставшиеся лизаты, обработанные ультразвуком, при температуре 4 °C до тех пор, пока они не будут готовы к инкубации с гранулами, покрытыми антителами.

4. Проверка созвучия

1. Приготовьте 20 мл 2x буфера протеиназы К, добавив 2 мл 0,5 М Tris-HCl (pH 8,0), 2 мл 0,5 M этилендиамина тетрауксусной кислоты (ЭДТА), 10 мл 10% додецилсульфата натрия (SDS) и 6 мл автоклавированного ddH₂O. Не добавляйте CPI в этот буфер. Хранить в тубе объемом 50 мл на RT.
2. Чтобы обратить вспять сшивку белок-ДНК, удаляя белки, возьмите 30 мкл ультразвукированного хроматина из каждого образца (начиная с шага 3.6), добавьте 166 мкл автоклавированного ddH₂O, 200 мкл 2x протеиназы К буфера и 4 мкл 20 мг/мл протеиназы К. Кратковременно обведите образцы вихрем, а затем инкубируйте при 65 °C в течение 1−3 ч при 24 x g.
3. ПРИМЕЧАНИЕ: Лизаты, обработанные ультразвуком, могут быть сшиты при температуре 65 °C в течение ночи.
4. Извлеките ДНК с помощью фенола:хлороформа:изоамилового спирта (PCIA: 25:24:1) и метода осаждения этанола следующим образом.
   осторожность: PCIA токсичен. Используйте под вытяжным шкафом со стандартными средствами индивидуальной защиты (СИЗ).
   1. Добавьте 400 мкл PCIA в каждый образец в пробирки объемом 1,5 мл, установите вихревую скорость и заведите образцы на 20 с. Центрифугируйте при 18 400 x g в течение 6 мин при RT. Будут наблюдаться две фазы. Осторожно перенесите верхний водный слой (прозрачную фазу) каждого образца в новые пробирки объемом 1,5 мл.
   2. Добавьте 1 мкл 10 мг/мл РНКазы А. Инкубируйте образцы при 37 °C в течение 30 минут.
   3. Добавьте 1 мкл 20 мг/мл гликогена в каждый образец, затем высадите в осадке 1 мл ледяного 100% этанола (хранящегося в морозильной камере при температуре -20 °C). Быстро перемешайте, затем инкубируйте образцы в морозильной камере при температуре -80 °C от 30 минут до 1 часа. Центрифугируйте образцы при давлении 18 400 x g в течение 10 минут при 4 °C и осторожно вылейте 100% этанол.
   4. Промойте гранулы 500 μл ледяного 70% этанола (хранящегося в морозильной камере при температуре -20 °C). Центрифугируйте при 18 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Осторожно вылейте 70% этанола.
   5. Инкубируйте образцы в пробирках объемом 1,5 мл при температуре 50 °C до тех пор, пока оставшийся этанол не испарится. Ресуспендируйте гранулы ДНК в 15 мкл автоклавного ddH2O или безнуклеазного ddH2O.
   6. Пропустите извлеченные образцы ДНК вместе с лестницей ДНК в 1,5% агарозном геле при напряжении 120−180 В и проверьте размер обработанной ультразвуком ДНК.

5. Инкубация антител с гранулами

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги в этом протоколе относятся примерно к 2 x 10⁷ нейронным клеткам, дифференцированным от мышиных ES-клеток. Ни в коем случае не замораживайте и не размораживайте магнитные шарики во время действия протокола ChIP-exo, так как шарики могут треснуть, что приведет к загрязнению образца или нарушению работы антител.

1. После лизиса клеток и ультразвуковой обработки приготовьте магнитные шарики протеина G (Таблица материалов) для ChIP, смешайте магнитные шарики до однородности, затем добавьте 25 μл магнитных шариков в 2 мл пробирок с низким связыванием белка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тип используемых магнитных шариков будет зависеть от вида антител.
2. Промойте шарики 1 мл блокирующего раствора (Таблица 1), хорошо перемешайте, затем поместите на магнитную решетку на 1 минуту. Все еще находясь на магнитной стойке, удалите надосадочную жидкость, как только она станет прозрачной.
3. Добавьте 1 мл блокирующего раствора в магнитные шарики. Скальные трубы в течение 10 мин при 4 °C на качающейся платформе. Кратковременно открутите, затем поместите пробирки на магнитный штатив и удалите надосадочную жидкость.
4. Повторите шаг 5.3 еще два раза.
5. Добавьте 500 мкл блокирующего раствора в магнитные шарики. Кратковременно раскрутите антитело против Isl1 (0,04 мкг/л, Таблица материалов), затем добавьте 4 мкг антитела в соответствующие 2 мл пробирки с низким связыванием белка, содержащие магнитные шарики в блокирующем растворе.
6. Повторите шаг 5.5 без антител (т.е. контроль без антител для ChIP).
   заметка: Количество добавляемого антитела может быть определено эмпирически с учетом качества антитела и количества клеток, используемых для ChIP.
7. Образцы породы при 4 °C в течение 6−24 ч на качающейся платформе.

6. Иммунопреципитация хроматина (ChIP)

1. Промойте покрытые антителами шарики с шага 5.8 1 мл блокирующего раствора. Поместите образцы на качающуюся платформу при температуре 4 °C на 5 мин. Удалите надосадочную жидкость.
2. Повторите шаг 6.1 еще два раза.
3. Ресуспендируйте гранулы, покрытые антителами, в 50 мкл блокирующего раствора, затем переложите в новые пробирки с низким уровнем связывания белка объемом 2 мл. Для каждого образца ChIP добавьте лизаты, обработанные ультразвуком (~1,0 мл от шага 3.6) к гранулам, покрытым антителами, в пробирках с низким связыванием белка объемом 2 мл.
4. Инкубируйте каждый образец на качающейся платформе в течение ночи при температуре 4 °C.

7. Чип моет

ПРИМЕЧАНИЕ: Храните образцы на льду или при температуре 4 °C, чтобы сохранить сшивку белка и ДНК во время промывки ChIP.

1. Сделайте промывочный буфер с высоким содержанием солей, промывочный буфер LiCl и 10 мМ буфер Tris-HCl (pH 7,4), как описано в таблице 2. Хранить в пробирках объемом 50 мл при температуре 4 °C. Добавьте 50 мкл 1000x CPI stock во все буферы непосредственно перед использованием.
2. Кратковременно открутите образцы в пробирках с низким уровнем связывания белка объемом 2 мл для сбора жидкости из колпачков, затем поместите на магнитный штатив на 1 мин и осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
3. Для промывки ChIP добавьте 1 мл буфера для лизиса 3 (при 4 °C) в каждую пробирку. Перемешивайте на качающейся платформе при температуре 4 °C в течение 5 минут. Кратковременно открутите образцы, затем поместите на магнитную решетку на 1 минуту и удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
4. Добавьте 1 мл холодного буфера для промывки с высоким содержанием соли в каждую пробирку. Перемешивайте на качающейся платформе при температуре 4 °C в течение 5 минут. Кратковременно открутите образцы, затем поместите на магнитную решетку на 1 мин и удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
5. Добавьте 1 мл холодного промывочного буфера LiCl в каждую пробирку. Перемешивайте на качающейся платформе при температуре 4 °C в течение 5 минут. Кратковременно открутите образцы, затем поместите на магнитную решетку на 1 мин и удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
6. Добавьте 1 мл холодного 10 мМ буфера Tris-HCl (pH 7,4) в каждую пробирку. Перемешивайте на качающейся платформе при температуре 4 °C в течение 5 минут. Кратковременно открутите образцы, затем поместите на магнитный штатив на 1 минуту и удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
   заметка: Вместо буфера Tris-HCl (pH 7,4) можно использовать буфер Tris-EDTA (pH 8,0).

Таблица 1: Рецепты для буферов лизиса 1−3 и блокирующего буфера. Хранить в пробирках объемом 50 мл при температуре 4 °C. Добавьте 50 мкл 1000x CPI (полного ингибитора протеазы) во все буферы непосредственно перед использованием.

См.

Буфер лизиса 1
реагент	Объем (мл)	[Финал]
1 М HEPES (pH 7,3)	2.5	50 мМ
5 млн NaCl	1.4	140 мМ
0,5 М ЭДТА (pH 8,0)	0,1	1 мМ
50% глицерин	10	10%
10% октилфенолэтоксилат	2.5	0,50%
10% 2-[4-(2,4,4-триметилпентан-2-ил)фенокси]этанол	1.25	0,25%
Автоклавный ddH2O	Заполнить до 50
Буфер для лизиса 2
реагент	Объем (мл)	[Финал]
0,5 М Tris-HCl (pH 8,0)	1	10 мМ
5 млн NaCl	2	200 мМ
0,5 М ЭДТА (pH 8,0)	0,1	1 мМ
Автоклавный ddH2O	Заполнить до 50
Буфер лизиса 3
реагент	Объем (мл)	[Финал]
1 м Tris-HCl (pH 8,0)	0,5	10 мМ
5 млн NaCl	1	100 мМ
0,5 М ЭДТА (pH 8,0)	0,1	1 мМ
10% дезоксихолевая кислота	0,5	0,10%
30% раствор N-лауроилсаркозина натриевой соли	0,83	0,50%
Автоклавный ddH2O	Заполнить до 50
Решение для блокировки
реагент	количество	[Финал]
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	250 мг	0,50%
Полный ингибитор протеазы (CPI, 1000x)	50 μл	1x
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Наполните до 50 мл

Таблица 2: Рецепты для промывки ChIP: буфер для промывки с высоким содержанием соли, буфер LiCl для промывки и 10 мМ буфер Tris-HCl (pH 7.4). Хранить в пробирках объемом 50 мл при температуре 4 °C. Добавьте 50 мкл 1000x CPI stock во все буферы непосредственно перед использованием.

мм

Буфер для промывки с высоким содержанием соли
реагент	Объем (мл)	[Финал]
1 М HEPES (pH 7,3)	2.5	50 мМ
5 млн NaCl	5	500 мМ
0,5 М ЭДТА (pH 8,0)	0,1	1 мМ
10% 2-[4-(2,4,4-триметилпентан-2-ил)фенокси]этанол	5	1%
5% дезоксихолевая кислота	1	0,10%
5% паспорта безопасности	1	0,10%
Автоклавный ddH2O	Заполнить до 50
LiCl буфер для стирки
реагент	Объем (мл)	[Финал]
0,5 М Tris-HCl (pH 8,0)	2	20 мМ
0,5 М ЭДТА (pH 8,0)	0,1	1 мМ
1 М LiCl	12,5	250 мМ
10% октилфенолэтоксилат	2.5	0,50%
5% дезоксихолевая кислота	5	0,50%
Автоклавный ddH2O	Заполнить до 50
10 mM Tris-HCl буфер
реагент	Объем (мл)	[Финал]
1 М Tris-HCl (pH 7,4)	0,5	10 мМ
Автоклавный ddH2O	Заполнить до 50

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Агароза, УльтраПьюр	Инвитроген	16500	Проверка ультразвуковой обработки (раздел 4.3.6)
Альбумин, сыворотка крупного рогатого скота (BSA), без протеазы, изоляция теплового шока, мин. 98%	БиоШоп	АЛЬБ003	Решение для блокировки
Антитела против Isl1	ДШБ	39.3Ф7	Введение антител с помощью гранул (раздел 5.6)
Биоруптор Пико	Диагенод	B01060010	Ультразвуковой хроматин (раздел 3.3)
Центрифуга 5424 R	Эппендорф	5404000138	Ультразвуковая обработка хроматином (раздел 3.5), проверка ультразвуковой обработки (разделы 4.3.1, 4.3.3 и 4.3.4)
Центрифуга 5804 R	Эппендорф	22623508	Забор, сшивание и замораживание клеток (раздел 1.3), лизис клеток (раздел 2.2 и 2.3), ультразвуковой хроматин (раздел 3.1)
Комплексный, мини, не содержащий ЭДТА коктейль ингибиторов протеазы	Рош	4693159001	Добавлен во все буферы, кроме буфера Proteinase K и буфера для элюирования ChIP
Дезоксихолевая кислота натриевая соль	Научный Фишер	БП349	Буфер для лизиса 3, буфер для промывки с высоким содержанием солей и буфер для промывки LiCl
ЭДТА, 0,5 м, стерильный раствор, pH 8,0	БиоШоп	ЭДТ111	Буфер для лизиса 1-3, проверочный ультразвуковой анализ (раздел 4.1), буфер для промывки с высоким содержанием солей, буфер для промывки LiCl и буфер для элюирования ChIP
Спирт этиловый безводный, 100%	Коммерческие спиртные напитки	P006EAAN	Проверка ультразвуковой обработки (раздел 4.3.3)
Формальдегид, 36,5-38%, содержит 10-15% метанола	сигма	Ф8775	Заготовительные, сшивающие и замораживающие клетки (раздел 1.1)
Глицерин, класс реагента, не менее 99,5%	БиоШоп	ГЛИ002	Буфер для лизиса 1
Глицин, биотехнологическая марка, мин. 99%	БиоШоп	GLN001	Сборочные, сшивающие и замораживающие клетки (раздел 1.2)
Гликоген, класс РНК	Термо Сайентиал	Р0551	Проверка ультразвуковой обработки (раздел 4.3.3)
HEPES, 1 м стерильно-фильтрованный раствор, pH 7,3	БиоШоп	НЭП003	Буфер для лизиса 1, буфер для промывки с высоким содержанием солей
Хлорид лития (LiCl), марка реагента	Биошоп	ЛИТ704	LiCl Буфер для промывки
Магнитные шарики для ChIP (Dynabeads Protein G)	Dynabeads Protein G (магнитные шарики для ChIP)	Dynabeads Protein G (магнитные шарики для ChIP)	Инкубация антител с гранулами (раздел 5)
Магнитный штатив (магнит DynaMag-2)	Инвитроген	12321Д	Используется в несколько этапов в разделах: 5
N-лауроилсаркозин натриевая соль, 30% водный раствор, ≥97,0% (ВЭЖХ)	сигма	No 61747	Буфер для лизиса 3
Октилфенолэтоксилат (IGEPAL CA630)	БиоШоп	НЕ999	Буфер для лизиса 1 и буфер для промывки LiCl
Фенол:Хлороформ:Изоамиловый спирт, биотехнологический класс (25:24:1)	БиоШоп	ПЭ512	Проверка ультразвуковой обработки (раздел 4.3.1)
Фосфатно-солевой буфер (PBS), 1x	Корнинг	21040С.В.	Забор, сшивание и замораживание клеток (раздел 1.3) и ультразвуковой хроматин (раздел 3.1), инкукация антител шариками (раздел 5.1)
Базовый блок питания PowerPac	БиоРад	1645050	Проверка ультразвуковой обработки (раздел 4.3.6)
Раствор протеиназы К, класс РНК	Инвитроген	25530049	Проверка ультразвуковой обработки (раздел 4.2)
Рназа А, Дназе и без протеазы	Термо Сайентиал	ЕН0531	Проверка ультразвуковой обработки (раздел 4.3.2)
Хлорид натрия (NaCl), биореагент	сигма	С5886	Буфер для лизиса 1-3, буфер для промывки с высоким содержанием солей
Додецилсульфат натрия (SDS), степень электрофореза	БиоШоп	СДС001	Проверка ультразвуковой обработки (раздел 4.1), буфер для промывки с высоким содержанием солей и буфер для элюирования ChIP
Ультразвуковые шарики и пробирки Bioruptor объемом 15 мл	Диагенод	C01020031	Ультразвуковая обработка хроматином (разделы 3.1 и 3.2)
Термомиксер F1.5	Эппендорф	5384000020	Разделы 4.2, 4.3.2 и 4.3.5
Раствор гидрохлорида Тризма (Tris-HCl), сертифицированный BioPerformance, 1 м, pH 7,4	сигма	Т2194	Буфер Tris-HCl 10 мМ
Раствор гидрохлорида тризмы (Tris-HCl), сертификат BioPerformance, 1 мес, pH 8,0	сигма	Т2694	Буфер для лизиса 2, буфер для лизиса 3, проверочный ультразвуковой анализ (раздел 4.1), буфер для промывки LiCl и буфер для элюирования ChIP
Мини-трубчатое коромысло VWR, регулируемая скорость	ВВР	10159-752 (Английский)	Используется в несколько этапов в разделах: 1, 2, 5, 6 и 7
2-[4-(2,4,4-триметилпентан-2-ил)фенокси]этанол, Тритон Х-100, реагентный класс	БиоШоп	ТРХ506	Буфер для лизиса 1, ультразвуковой хроматин (раздел 3.4) и буфер для промывки с высоким содержанием солей

шт.