Флуоресцентное иммуноокрашивание срезов органоидов мозжечка

Аннотация

Источник: Silva, T. P., et al., Масштабируемое генерирование зрелых мозжечковых органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека и характеристика с помощью иммуноокрашивания. J. Vis. Exp. (2020)

Это видео демонстрирует иммунофлуоресцентное окрашивание срезов органоидов мозжечка для идентификации специфических целевых антигенов, экспрессируемых в различных нейронах мозжечка, которые указывают на созревание органоидов.

Протокол

1. Иммуноокрашивание органических срезов

1. Поместите предметные стекла микроскопа, содержащие срезы органоидов, в банку с 50 мл предварительно подогретого 1x PBS, держа до 10 слайдов спиной к спине.
   заметка: Все участки органоида должны быть погружены в жидкость.
2. Выдерживать в течение 45 минут при 37 °C для дежелатинизации предметных стекол.
3. Промыть 1x 50 мл 1× PBS в течение 5 минут при RT: Переложите предметные стекла в банку, содержащую свежие 1× PBS.
4. Переложите предметные стекла в банку, содержащую 50 мл свежеприготовленного глицина (Таблица 1), и инкубируйте в течение 10 минут при RT.
5. Переложите предметные стекла в банку, содержащую 50 мл 0,1% тритона (Таблица 1) и пермеабилизируйте в течение 10 минут при RT.
6. Умываться 1× PBS в течение 5 мин 2x.
7. Приготовьте иммуноокрашивающую форму из бумаги толщиной 3 мм, смоченной в 1× PBS. Высушите слайды салфеткой вокруг срезов и поместите их на бумагу толщиной 3 мм. С помощью пипетки Пастера покройте всю поверхность предметных стекол блокирующим раствором (Таблица 1), 0,5 мл на предметное стекло. Инкубировать в течение 30 минут при RT.
8. Удалите излишки блокирующего раствора и высушите предметные стекла салфеткой вокруг ломтиков. На срезы нанесите 50 мкл первичного антитела (табл. 2), разведенного в блокирующем растворе, и накройте покровными стеклами. Поместите ломтики в заранее подготовленную посуду для иммуноокрашивания. Выдерживать в течение ночи при температуре 4 °C.
9. Переложите предметные стекла в банку с 50 мл TBST (Таблица 1), дайте покровным стеклам упасть и промойте TBST в течение 5 минут 3 раза.
10. На срезы нанесите 50 мкл вторичного антитела, разведенного в блокирующем растворе, и накройте покровными стеклами. Поместите ломтики в заранее подготовленную форму для иммуноокрашивания. Инкубировать в течение 30 минут при RT в защищенном от света месте.
11. Снова переложите предметные стекла в банку для копирования и промойте 50 мл TBST в течение 5 минут 3 раза.
12. Высушите слайды салфеткой вокруг ломтиков и поместите ломтики в заранее подготовленную форму для окрашивания иммунитета. С помощью пипетки Пастера добавьте 0,5 мл раствора DAPI по всей поверхности предметных стекол. Инкубировать в течение 5 минут при RT.
13. Повторите шаг 1.9.
14. Тщательно просушите горки салфеткой. Капля за каплей добавляйте 50 μл монтажного материала вдоль предметного стекла, а затем осторожно опускайте покровное стекло на каждое предметное стекло, слегка изгибая его, чтобы избежать образования пузырей.

Таблица 1: Растворы для получения органоидов для криосекции и иммуноокрашивания. Перечислены все компоненты и объемы, использованные для приготовления растворов, используемых при получении органоидов для криосекции и иммуноокрашивания.

%

Желатин/Сахароза Конечная концентрация: 7,5%/15% по мас.	1. Взвесьте 15 г сахарозы и 7,5 г желатина в стерильной стеклянной бутылке Schott Glass Bottle и хорошо перемешайте<бр/> 2. Предварительно прогрейте PBS 1x до 65 °C 3. Добавьте предварительно подогретый PBS 1x к итоговому весу 100 г и хорошо перемешайте 4. Поместите стеклянную бутылку Schott в нагревательную тарелку при температуре 65 °C и встряхивайте, пока желатин не растает 5. Инкубировать при 37 °C до стабилизации раствора
Глицин<бр /> Конечная концентрация: 0,1 м	Добавьте 0,37 г глицина в 50 мл свежеприготовленного PBS 1x.
Triton solution Конечная концентрация: 0,1 % по массовому объему	1. Приготовьте 10 % бульон Triton X-100: 5 г Triton X-100 в 50 мл PBS 1x 2. Добавьте 0,5 мл бульона Triton X-100 в 50 мл PBS 1x.
TBST 20 мМ Tris-HCl pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,05 % w/v Tween-20	20 мл Tris 1 M 30 мл NaCl 5 M 5 мл Tween-20 (10 % запаса: 5 г Tween-20 на 50 мл воды) Залейте до 1 л воды.
Решение для блокировки	Добавьте 5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS, конечная концентрация: 10 % v/v) к 50 мл TBST.
Решение DAPI	Добавьте 15 мкл стокового раствора DAPI (1 мг/мл) в 10 мл дистиллированной воды
Мовиол	1. Добавьте 2,4 г Mowiol к 6 г глицерина и взбалтывайте в течение 1 часа в предварительно разогретой тарелке при температуре 50 °C 2. Добавьте 6 мл дистиллированной воды и встряхивайте 2 ч<бр/> 3. Добавьте 12 мл Tris 200 mM (pH 8,5) и взбалтывайте в течение 10 мин<бр/> 4. Центрифугируйте при 5 000 × г в течение 15 мин5. Аликвот и хранить при температуре -20 °C.

Таблица 2: Первичные антитела. Перечислены первичные антитела, клоны и оптимизированные разведения, используемые для иммуноокрашивания.

антитело	Виды хозяев	разбавление
БАРХЛ1	кролик	1/500
КАЛЬБИНДИН	кролик	1/500
МАП2	мышь	1/1000
N-КАДГЕРИН	мышь	1/1000
НЕСТИН	мышь	1/400
ОЛИГ2	кролик	1/500
ПАКС6	кролик	1/400
СОКС2	мышь	1/200
ТБР1	кролик	1/200
ТБР2	кролик	1/200
ТУЙ1	мышь	1/1000

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бумага 3 мм	WHA3030861	Мерк
Антитела к BARHL1	HPA004809	Антитела к Атласу
Антитела к кальбиндину D-28k	КБ28	Многородность
Антитела к MAP2	М4403	сигма
Антитела к N-кадгерину	610921	BD Трансдукция
Антитела против NESTIN	MAB1259-СП	НИОКР
Антитела к OLIG2	МАБН50	Многородность
Антитела Anti-PAX6	ПРБ-278П	Кованс
Антитела к SOX2	MAB2018	НИОКР
Антитела к TBR1	АБ2261	Многородность
Антитела к TBR2	АБ183991	Абкам
Антитела к TUJ1	801213	Биолегенда
Покровные накладки 24x60мм	631-1575	ВВР
DAPI	10236276001	сигма
Фетальная бычья сыворотка	A3840001	ТермоФишер
Желатин из бычьей кожи	Г9391	сигма
Стеклянная банка для коплинга	Е94	ТермоФишер
глицин	MB014001	NZYtech
Монотиоглицерин	М6154	сигма
Мовиол	475904	Многородность	Монтажный материал
Тритон Х-100	9002-93-1	сигма
Подросток-20	П1379	сигма
Предметные стекла для микроскопа SuperFrost	12372098	ТермоФишер	Предметные стекла для адгезионного микроскопа

гг.