$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Создание церебральных органоидов из iPSC / hESC 2D культуры (День 0)
Примечание: Этот протокол предполагает, что поддержание стволовых клеток (SC) проводится в среде для поддержания стволовых клеток (SCMM), свободной от ксено, с помощью субстрата витронектина или Geltrex. При использовании альтернативной среды для культивирования стволовых клеток с высоким содержанием белка целесообразно переводить культуры СК в СКММ в течение как минимум двух пассажей до начала формирования органоидов. Протокол не тестировался с использованием методов культивирования СК на основе фидеров.
- Используя регулярные методы поддержания СК, доведите посевы до 50%-70% конфлюенции. Обычно это происходит через 3-4 дня после пассирования, хотя это может зависеть от метода культивирования и клеточной линии.
заметка: Примерно 2 лунки из 6-луночной пластины необходимы для производства полной 96-луночной пластины органоидов.
- Осматривайте культуры с помощью светлопольной микроскопии с увеличением 10-20X, чтобы убедиться в здоровой морфологии колонии без обнаруживаемой дифференцировки.
- Доведите SCMM до 37 °C в водяной бане и разморозьте флакон объемом 50 мкл 50 мМ Y-27632 (ингибитор породы) и 2 мл реагента для ферментативного отслоения до комнатной температуры.
- Подготовьте 96-луночную пластину U-образного дна со сверхнизкой насадкой (ULA), многоканальную пипетку P200 и резервуар для реагентов объемом 25 мл.
- Добавьте 45 мл SCMM в коническую пробирку объемом 50 мл и добавьте 45 мкл 50 мл Y-27632. Тщательно перемешайте, перемешав.
- Вакуумируйте две лунки, содержащие СК, и быстро добавьте 1 мл реагента для отслоения без ферментов в каждую лунку с помощью пипетки P1000. Инкубируйте планшет в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 4 минут.
- Вакуумную аспирацию обработанных лунок и добавление 1 мл реагента для ферментативной отслойки в каждую лунку с помощью пипетки P1000.
- Инкубируйте планшет в инкубаторе при температуре 37 °C еще 5 минут.
- Снимите пластину и осмотрите обработанные лунки. Аккуратно постучите по пластине, чтобы разбить агрегированные ячейки. Если крупные клеточные кластеры все еще видны, инкубируйте планшет еще 2 минуты при 37 °C. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока кластеры не перестанут быть видимыми невооруженным глазом.
- После того, как клетки будут правильно диссоциированы, добавьте 1 мл SCMM в каждую лунку, чтобы деактивировать ферменты диссоциации. Соберите 4 мл клеточной суспензии в коническую пробирку объемом 50 мл и возьмите небольшую аликвоту для подсчета клеток.
- Верните все оставшиеся, необработанные лунки в поддерживающей пластине в инкубатор при температуре 37 °C.
- Во время подсчета центрифугируйте клеточную суспензию при 300 х г в течение 5 мин.
- Определите общее количество клеток и рассчитайте количество раствора SCMM + Y-27632, которое потребуется для получения суспензии 60 000 клеток/мл.
- Тщательно вакуумируйте надосадочную жидкость и добавьте рассчитанный объем раствора SCMM + Y-27632. Смешайте 5-10 раз с пипеткой объемом 5 мл, обеспечивая равномерную клеточную суспензию.
- Немедленно перенесите суспензию ячейки в резервуар с реагентами и пипетируйте по 150 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета ULA U-bottom с помощью многоканальной пипетки P200. В результате получается 96 отдельных органоидов, каждый из которых изначально состоит из 9000 клеток.
- Центрифугируйте планшет при 150 x g в течение 1 минуты.
- Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C и не беспокойте планшет в течение 48 часов.
2. Поддержание церебральных органоидов (День 2)
- Приготовьте 17 мл SCMM с 17 мкл 50 мМ Y-27643 в конической пробирке объемом 50 мл. Нагрейте раствор SCMM+Y-27632 до 37 °C на водяной бане.
- Достаньте органоидную пластину из инкубатора и с помощью многоканальной пипетки P200, установленной на 75 μл, медленно набирайте среду от края лунки на первом ряду. После того, как среда будет извлечена, быстро вытолкните ее обратно в лунку, чтобы поднять свободные клетки и органоиды. Повторите это для каждой строки.
заметка: Этот метод, далее именуемый «дисперсией», поднимает клеточный мусор и органоид во взвешенное состояние. Органоид быстро опускается на дно скважины, в то время как более мелкий мусор остается во взвешенном состоянии, что позволяет удалить его при смене среды. Это помогает предотвратить пребывание органоида в клеточном мусоре во время культивирования.
- После того, как все лунки будут распределены, подождите 15 секунд, чтобы убедиться, что органоиды опустились на дно каждой лунки.
- Медленно и осторожно отсасывайте 75 мкл среды из каждой лунки с помощью многоканальной пипетки P200 и диспенсируйте в резервуар для отходов.
заметка: Большинство пользователей время от времени аспирируют органоид во время регулярных кормлений. Это может происходить примерно в 1% случаев. Пожалуйста, планируйте соответствующим образом, чтобы достаточное количество органоидов дожило до экспериментальных временных точек.
- Перелейте раствор SCMM + Y-27632 в резервуар для реагентов и диспонируйте по 150 мкл в каждую органоидную лунку с помощью многоканальной пипетки P200.
- Поместите планшет обратно в инкубатор с температурой 37 °C.
3. Поддержание церебральных органоидов (День 3)
- Нагрейте 17 мл SCMM до 37 °C, на этот раз без Y-27643.
- Установив многоканальный дозатор P200 на 100 μл, диспергируйте все лунки органоидной пластины (см. шаг 2.2). Подождите 15 с, чтобы убедиться, что органоиды опустились на дно своих колодцев.
- Подготовьте резервуар для отходов и перекачайте нагретый SCMM в исходный резервуар.
- Осторожно отасуньте 125 мкл среды из каждой лунки и замените 150 мкл свежей SCMM с помощью многоканальной пипетки P200.
- Поместите планшет обратно в инкубатор с температурой 37 °C.
4. Поддержание церебральных органоидов (День 4+)
Примечание: Проводите это регулярное обслуживание через день до заражения.
- Перед началом кормления на 4-й день приготовьте среду для нейронной индукции (NI).
- Разморозьте 250 мкл аликвоты 2 мг/мл гепарина вместе с одним флаконом 5 мл 100X N-2 добавки. Добавьте 250 мкл гепарина, 5 мл 100X N-2 и 5 мл 100X Минимальной незаменимой среды и заменимых аминокислот (MEM-NEAA) к 500 мл модифицированной орлиной среды/питательной смеси F-12 (DMEM/F12) + GlutaMAX от Dulbecco. Стерильно отфильтровать смешанный раствор в фильтре объемом 500 мл.<бр/>
Примечание: Держите NI на уровне 4 °C, когда он не используется; NI длится до двух недель, прежде чем должна быть приготовлена свежая среда.
- Нагрейте 17 мл NI среды до 37 °C.
- Установив многоканальный дозатор P200 на 100 μл, диспергируйте все лунки органоидной пластины (см. шаг 2.2). Подождите 15 с, чтобы убедиться, что органоиды опустились на дно своих колодцев.
- Подготовьте резервуар для отходов и перенесите нагретый NI в исходный резервуар.
- Осторожно отасуньте 125 мкл среды из каждой лунки и замените 125 мкл свежего NI с помощью многоканальной пипетки P200.
- Поместите планшет обратно в инкубатор с температурой 37 °C.
5. Органоидная инфекция вирусом Зика (ZIKV) (~День 24)
ПРИМЕЧАНИЕ: Примерно через 3 недели дифференцировки внутри органоида будут видны большие нейроэпителиальные структуры и розетки, которые будут очень восприимчивы к инфекции ZIKV.
- Доведите сбалансированный солевой раствор (EBSS) от Earle's 1X, фосфатно-солевой буфер (PBS) и NI до 37 °C на водяной бане.
- Разбавить ZIKV известной концентрации в 1X EBSS до целевой кратности инфекции (MOI).
заметка: Для достижения ответа на вирусную дозу рекомендуется титрование различных MOI. Это может варьироваться в зависимости от штамма вируса; для ATCC VR-1838 и ATCC VR-1843 типичные значения MOI находятся в диапазоне от 0,1 до 10).
- Тщательно удалите всю среду из органоида с помощью одноканальной пипетки P200. Быстро добавьте 200 мкл 1X PBS в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки P200 для промывки органоидов.
- Тщательно удалите всю среду из органоида с помощью одноканальной пипетки P200. Быстро добавьте 50 мкл раствора 1X EBSS-only (имитация инфекции) или вируса ZIKV в лунку и убедитесь, что органоид полностью погружен в воду. Повторите для каждого органоида, который должен быть инфицирован для исследования.
- Поместите планшет обратно в инкубатор с температурой 37 °C на 2 ч.<бр/>
заметка: Инкубация фиктивно инфицированных органоидов в течение этого периода не должна существенно влиять на их рост по сравнению с неповрежденными органоидами.
- Примерно за 30 минут до завершения инкубации вируса внесите 25 мл NI в коническую пробирку объемом 50 мл и доведите до 37 °C на водяной бане.
- После завершения воздействия вируса промойте органоиды 200 мкл 1X PBS для каждой лунки, дайте органоидам отстояться в течение 15 с, а затем удалите 1X PBS с помощью одноканальной пипетки P200.
- Добавьте 200 μL свежего NI в каждую лунку и поместите обратно в инкубатор.
- Дополнительно: Для точки времени дня 0 органоиды могут быть визуализированы через час после заражения.
- Продолжайте культивирование, заменяя 125 мкл NI через день с использованием дисперсионного метода (см. шаг 4). Обязательно правильно утилизируйте отработанные среды и наконечники, так как в них содержатся инфекционные частицы ZIKV.