Оценка жизнеспособности нейронов в культуре нейронов мозжечка с помощью двойного окрашивания

Аннотация

Источник: Jiajia, L., et al. Оценка жизнеспособности нейронов с помощью двойного окрашивания флуоресцеина диацетата-йодида пропидиума в культуре нейронов гранул мозжечка. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео демонстрирует метод идентификации нейронов из смешанной культуры гранулярных нейронов мозжечка и глиальных клеток с использованием двойного окрашивания флуоресцеином диацетатом (FDA) и йодидом пропидия (PI), где живые нейроны отображаются зеленым, а мертвые нейроны - красными.

Протокол

1. Двойное окрашивание FDA-PI и культура нейронов мозжечковой гранулы (CGN)

1. Готовьте рабочий раствор флуоресцеина диацетат-пропидида йодида (FDA-PI) путем добавления 20 мкл стокового раствора FDA (конечная концентрация: 10 мкг/мл) и 50 мкл стокового раствора PI (конечная концентрация: 50 мкг/мл) в 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Перемешайте с помощью вортекса и положите его на лед.
   заметка: Свежий рабочий раствор FDA-PI приготовьте непосредственно перед использованием.
2. Достаньте планшет для клеточной культуры из инкубатора. Положите его на лед.
3. Отсадите питательную среду и замените ее холодной PBS.
   заметка: Смена раствора должна производиться медленно и осторожно. Не прикасайтесь к ячейкам наконечниками пипетки.
4. Аспирируйте холодный PBS и замените его холодным FDA-PI (500 мкл/лунка для 12-луночных планшетов для клеточных культур или 1 мл/лунку для 6-луночных планшетов для клеточных культур). Оставить на льду на 5 минут.
5. Отсадите FDA-PI и добавьте холодный PBS (100 мкл/лунка для 12-луночных клеточных культуральных планшетов или 50 μл/лунку для 6-луночных клеточных культуральных планшетов).
   заметка: Нельзя допускать высыхания клеток при съемке.
6. Получение изображений с помощью флуоресцентной микроскопии. Используйте фильтр возбуждения с полосой пропускания 450 - 490 нм. Определение флуоресцентного излучения для FDA и PI на длинах волн 520 и 620 нм соответственно. В тех же условиях сделайте снимок при нормальном освещении с помощью фазово-контрастного режима флуоресцентной микроскопии.
   заметка: Сделайте снимки в течение 15 минут после FDA-PI. Время экспозиции составляет 100-300 мс, а аналоговое усиление – 2,8x.

2. Оценка жизнеспособности нейронов

1. Для двойного окрашивания FDA-PI наложите изображения клеток, обнаруженных после фильтрации различными флуоресцентными фильтрами, перетащив FDA-положительный слой на PI-положительный слой в программном обеспечении графического редактора.
   1. Отрегулируйте непрозрачность FDA-положительного слоя, введя «50%» в поле «Непрозрачность» на панели «Слои». Объедините два слоя, нажав на кнопку "Объединить видимые" в меню "Слой". Установите контрастность наложенных изображений, введя "50" в поле "Контрастность" в разделе "Изображение"| "Корректировки" | "Яркость/Контрастность." Убедитесь, что на наложенных изображениях нет двойных положительных клеток FDA и PI.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	10099141	высокое качество FBS имеет важное значение для культуры
100× глютамин	Gibco	25030081
100× антибиотик	Gibco	15240062
BME средний	Gibco	21010046
Флуоресцеиновый диацетат	сигма	Ф7378
Йодид пропидия	сигма	П4170
Антитело Rabbit Anti-GAP43	Абкам	АБ75810
Мышиные антитела к GFAP	Клеточная сигнализация	No 3670
Пастеровская пипетка	Волак	Z310727	Перед использованием сожгите кончик
6-луночные планшеты для культивирования клеток	ТЭС	Z707759	Высокое качество планшета для культивирования клеток имеет важное значение для культивирования
фильтр	Многородность	SLGP033RB
Пипетка 5 мл	Превосходная биография	КС017-0003
Пипетка 10 мл	Превосходная биография	КС017-0004
CO2-инкубатор	Термо Сайентиал	311
Флуоресцентный микроскоп	Компания Nikon	ТИ-С
Флуоресцентный фильтр и эмиссионные кубы	Компания Nikon	В-2А, Г-2А, УФ-2А
Программное обеспечение для работы с фотографиями	Компания Nikon	Элементы НИС
Программный редактор графики	саман	Фотошоп CS
Программное обеспечение для обработки изображений	НИЗ	ИзображениеJ