Визуализация нейронов тела гриба в мозге дрозофилы с помощью иммуноокрашивания

Аннотация

Источник: Kelly, S. M., et al. Вскрытие и иммунофлуоресцентное окрашивание тел грибов и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого человека Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео демонстрирует подробный протокол иммуноокрашивания для визуализации фенотипических дефектов в грибовидных телах мутантного мозга дрозофилы. Протокол включает в себя использование антител против Fas2, белка, участвующего в аксональном руководстве, который способствует правильному морфологическому и функциональному развитию тела гриба.

Протокол

1. Процедура фиксации и иммунофлуоресцентного окрашивания

1. С помощью пипетки p200 перенесите препарированный мозг из 9-луночной чашки в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл, заполненную 0,5 мл 4% параформальдегида, разведенного в PTN (0,1 М буфер фосфата натрия pH 7,2, 0,1% неионогенное поверхностно-активное вещество). Не менее 10 - 15 мозгов одного и того же генотипа могут быть объединены в одну микроцентрифужную пробирку. Все остальные этапы (до установки мозгов на предметные стекла) выполняются в микроцентрифужных пробирках объемом 0,5 мл.
   осторожность: С параформальдегидом (PFA) следует работать в вытяжном ш....

Результаты

Рисунок 1. Монтирование мозга при подготовке к иммунофлуоресцентной визуализации. (A) Мозги установлены на предметных стеклах SuperFrost Plus с крышкой-мостом для предотвращения сплющивания мозга. Два «базовых» защитных стекла приклеиваются к положительно заряженному слайду SuperFrost Plus с прозрачным лаком для ногтей, а между ними помещаются препарированные мозги. Прозрачный чехол «мост» размещаетс.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микродиссекционные щипцы/пинцет	Тед Пелла	505-НМ
Блюда Sylgard	Контрольно-измерительные приборы для живых систем	ДД-50-С-БЛК	Доступно с amazon.com
Антитела к Fas2	Исследования в области развития, Банк гибридома	1D4
Антитела к чаоптину	Исследования в области развития, Банк гибридома	24В10
Антитела GFP	Лаборатория Aves	ГФП-1010
Alexa488 козий анти-мышь вторичные антитела	ТермоФишер	А-11001
Alexa488 козий анти-куриный < /> вторичные антитела	ТермоФишер	А-11039
Alexa647 козье вторичное антитело против мышей	ТермоФишер	А-21236
20% параформальдегид	Услуги электронного микроскопа	RT15713
ВектаЩит	Векторные лаборатории	Н-1000
Горки SuperFrost Plus	ТермоФишер	99-910-01
Покровные стекла	ТермоФишер	Тел.: 12-553-454
Na фосфатный буфер одноосновной	сигма	С3139
Na фосфатный буфер двухосновной	сигма	С3264
Тритон Х 100	сигма	Х100-100мл
лак для ногтей	Услуги электронного микроскопа (EMS)	72180
Стереомикроскоп	Leica S6D со светодиодным источником света KL300
Тарелка на 9 лунок (точечная тарелка)	ВВР	89090-482
Nutator/Rocker	рыбак	22-363-152 или 88-861-041
Тарелка 35 мм	Дженеси Сайентиал	32-103
Сильгард	рыбак	Тел.: 50-366-794
Кимвайп	рыбак	06-666
Буферы потенциальной фиксации
Буфер PTN			0,1М NaPhosphate, pH 7,2, 0,1% Triton-X-100, обычно составляют 0,5 л 0,1M NaPhosphate буфера и алиquote 50 мл за раз по мере необходимости
Fly Stocks в Bloomington
elav (c155)-GAL4		БЛ458	Паннейрональный драйвер GAL4
w*;;; ОК107-ГАЛ4		БЛ 854	Драйвер GAL4 для всех нейронов тела гриба (вставка OK107-GAL4 находится на 4-й хромосоме)
y(1), w(67c23); c739-GAL4		BL 7362	Драйвер GAL4 для альфа- и бета-долей (на 2-й хромосоме)
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP		BL 64305	Драйвер GAL4 для альфа- и бета-долей, также содержит UAS-CD8-GFP
w*; 201Y-GAL4		БЛ 4440	Драйвер GAL4 в первую очередь для гамма-лепестков тела гриба (на 2-й хромосоме)
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS- CD8-GFP		BL 64296	Драйвер GAL4 для гамма-лепестков тела гриба, также содержит UAS-CD8-GFP