Визуализация нейронов тела гриба в мозге дрозофилы с помощью иммуноокрашивания

Аннотация

Источник: Kelly, S. M., et al. Вскрытие и иммунофлуоресцентное окрашивание тел грибов и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого человека Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео демонстрирует подробный протокол иммуноокрашивания для визуализации фенотипических дефектов в грибовидных телах мутантного мозга дрозофилы. Протокол включает в себя использование антител против Fas2, белка, участвующего в аксональном руководстве, который способствует правильному морфологическому и функциональному развитию тела гриба.

Протокол

1. Процедура фиксации и иммунофлуоресцентного окрашивания

1. С помощью пипетки p200 перенесите препарированный мозг из 9-луночной чашки в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл, заполненную 0,5 мл 4% параформальдегида, разведенного в PTN (0,1 М буфер фосфата натрия pH 7,2, 0,1% неионогенное поверхностно-активное вещество). Не менее 10 - 15 мозгов одного и того же генотипа могут быть объединены в одну микроцентрифужную пробирку. Все остальные этапы (до установки мозгов на предметные стекла) выполняются в микроцентрифужных пробирках объемом 0,5 мл.
   осторожность: С параформальдегидом (PFA) следует работать в вытяжном шкафу. Отходы PFA следует сохранять и правильно утилизировать. Двадцать процентов параформальдегида, приобретенного в стеклянных ампулах, могут быть аликвотированы в микроцентрифужные пробирки и храниться при температуре -20 °C до тех пор, пока не понадобятся.
2. Внутри вытяжного шкафа инкубируйте мозг в 4% параформальдегиде в течение 20 минут с медленным покачиванием при комнатной температуре.
3. После фиксации позвольте мозгу осесть на дно микроцентрифужной пробирки под действием силы тяжести.
   заметка: Мозг может время от времени прилипать к боковой стороне микроцентрифужной пробирки. Если это происходит, обычно полезно повернуть трубку в сторону между указательным и большим пальцами или осторожно постучать трубкой по скамье, чтобы способствовать погружению мозга.
4. Снимите фиксатор с помощью пипетки p1000 и выполните два «быстрых» промывки 500 μл PTN, позволяя мозгу осесть на дно микроцентрифужной пробирки между промывками. Во время этих быстрых промывок, как только все мозги под действием силы тяжести осядут на дно микроцентрифужной пробирки, PTN можно немедленно заменить на свежий буфер; Дополнительное время стирки не требуется.<чел/> заметка: Как правило, предпочтительнее оставлять дополнительный буфер в трубке, чем рисковать удалением мозга. Часто требуется тщательное обследование наконечника пипетки, чтобы убедиться, что мозг не был случайно удален из трубки. Если мозг был случайно помещен пипеткой в наконечник, поместите его обратно в микроцентрифужную пробирку, подождите, пока мозг осядет, а затем продолжайте удалять остатки PTN.
5. После последней быстрой промывки с помощью пипетки p1000 выполните три «длинных» промывки: добавьте 500 μL PTN и промывайте в течение 20 минут при комнатной температуре на коромысле/нутаторе. Все последующие «длинные» стирки должны быть по 20 мин.<бр/> заметка: После этих промываний неподвижный мозг может храниться в течение ночи при температуре 4 °C в PTN.
6. Удалите последнюю полоску с помощью пипетки p1000 и инкубируйте мозги на коромысле или нутаторе при комнатной температуре в 0,5 мл блокирующего раствора [PTN + 5% нормальной козьей сыворотки (NGS)] в течение не менее 30 минут при комнатной температуре.
   1. Вторичные антитела к козам будут использоваться на последующих этапах протокола. Если используются вторичные антитела из другого вида, в блокирующих растворах и растворах антител следует использовать нормальную сыворотку из этого вида (а не NGS).
7. С помощью пипетки p1000 удалите блокирующий раствор и добавьте первичное антитело, разведенное в PTN (PTN + 5% NGS + разведенное первичное антитело). При первом использовании первичного антитела оптимальное разведение этого антитела должно быть определено опытным путем.
   заметка: Для визуализации нейронов грибовидных тел обычно используются антитела, распознающие Fas2. Эти антитела доступны в Банке гибридома исследований развития (DSHB) в виде антитела 1D4 и должны быть разведены в соотношении 1:20 в PTN + 5% NGS.
8. Инкубируйте мозг в первичном растворе антител на коромысле/нутаторе в течение 2 - 3 ночей при 4 °C.
9. После инкубации с первичными антителами дайте мозгу осесть на дно микроцентрифужной пробирки, а затем удалите раствор первичного антитела.
10. С помощью пипетки p1000 выполните 2 «быстрых» промывки и 3 «длинных» 20-минутных промывки 0,5 мл PTN, как описано выше в шагах 1.4 и 1.5, осторожно позволяя мозгу под действием силы тяжести осесть на дно микроцентрифужной пробирки между каждым промывкой.
11. Инкубируйте мозг в течение 3 ч при комнатной температуре с соответствующими флуоресцентно мечеными вторичными антителами. Вторичные антитела обычно разводят в 0,5 мл PTN + 5% NGS в концентрации 1:200,
    заметка: После добавления флуоресцентных вторичных антител мозг следует держать в темноте до конца эксперимента.
12. После инкубации вторичных антител дайте мозгу осесть на дно микроцентрифужной пробирки и удалите раствор вторичного антитела.
13. Выполните 2 «быстрых» промывки и 3 «длинных» промывки по 20 минут с 0,5 мл PTN, как описано выше в шагах 1.4 и 1.5, осторожно позволяя мозгу осесть на дно микроцентрифужной пробирки между каждым промыванием.
14. После третьего «длинного» 20-минутного промывки используйте пипетку p200, чтобы удалить как можно больше буфера.
15. Добавьте в мозг 75 мкл флуоресцентной монтажной среды, препятствующей выцветанию. Соедините мозги пипетки и вставляйте рабочую среду в наконечник пипетки один раз для смешивания. Не переворачивайте трубку, так как мозг может застрять на крышке или по бокам микроцентрифужной пробирки.
    заметка: После суспензии мозгов в монтажной среде пробирки могут быть обернуты алюминиевой фольгой для замедления тушения флуорофора и храниться при температуре 4 °C в течение ночи. При необходимости мозг можно хранить в течение нескольких дней при температуре 4 °C, но в идеале его следует как можно скорее установить на предметные стекла.

2. Крепление мозга взрослого D. melanogaster на предметные стекла и визуализация

1. Соорудите горку-«мостик». Расположите два «базовых» покровных стекла на расстоянии примерно 1 см друг от друга на положительно заряженном предметном стекле. Убедитесь, что положительно заряженная сторона предметного стекла обращена вверх. Приклейте покровные стекла к предметному стеклу лаком для ногтей, как показано на рисунке 1А. Герметизация трех внешних краев каждого защитного стекла основания лаком для ногтей обычно полезна, чтобы монтажный материал не впитывал под эти защитные стекла. Дайте лаку для ногтей полностью высохнуть (10 - 15 минут) перед тем, как продолжить.
2. Поместите предметное стекло под стереомикроскоп и внесите пипеткой раствор монтажной среды, содержащий расчлененные мозги, в пространство между двумя покровными стеклами. Чтобы обеспечить больший контраст, полезно маневрировать светильниками на гусиной шее так, чтобы они были параллельны столешнице.
3. Удалите лишний монтажный материал с предметного стекла с помощью пипетки, стараясь не зацепить мозги от предметного стекла.
4. Уберите лишний монтажный носитель. Это позволит более точно расположить мозг на следующем этапе.
5. С помощью пары щипцов и стереомикроскопа расположите мозг на предметном стекле в виде сетки антенными лепестками вверх.
6. Наденьте на мозг защитный лист («мост») (рисунок 1A). Используйте лак для ногтей, чтобы запечатать стороны накладки крышки моста в местах, где они соприкасаются с «базовыми» накладками.
7. С помощью пипетки p200 медленно заполните центральную полость под мостом свежей монтажной средой (рис. 1B). Помещайте по одной капле на открытый край центрального покровного стекла и дайте монтажному материалу впитать жидкость под покровное стекло центрального моста. Продолжайте до тех пор, пока вся полость не будет заполнена монтажным материалом, затем заклейте верхнюю и нижнюю части прозрачным лаком для ногтей.
8. Как только лак для ногтей высохнет, немедленно сфотографируйте предметные стекла или храните в светонепроницаемой плотной коробке при температуре -20 °C.
9. В течение одной недели визуализируйте мозг с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа с возбуждающими лазерами и фильтрующими кубами, соответствующими выбранным флуоресцентным вторичным антителам. Z-стековые изображения нейронов грибовидных тел обычно получаются с использованием объективов 20X или 40X.

Результаты

Рисунок 1. Монтирование мозга при подготовке к иммунофлуоресцентной визуализации. (A) Мозги установлены на предметных стеклах SuperFrost Plus с крышкой-мостом для предотвращения сплющивания мозга. Два «базовых» защитных стекла приклеиваются к положительно заряженному слайду SuperFrost Plus с прозрачным лаком для ногтей, а между ними помещаются препарированные мозги. Прозрачный чехол «мост» размещаетс...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микродиссекционные щипцы/пинцет	Тед Пелла	505-НМ
Блюда Sylgard	Контрольно-измерительные приборы для живых систем	ДД-50-С-БЛК	Доступно с amazon.com
Антитела к Fas2	Исследования в области развития, Банк гибридома	1D4
Антитела к чаоптину	Исследования в области развития, Банк гибридома	24В10
Антитела GFP	Лаборатория Aves	ГФП-1010
Alexa488 козий анти-мышь вторичные антитела	ТермоФишер	А-11001
Alexa488 козий анти-куриный < /> вторичные антитела	ТермоФишер	А-11039
Alexa647 козье вторичное антитело против мышей	ТермоФишер	А-21236
20% параформальдегид	Услуги электронного микроскопа	RT15713
ВектаЩит	Векторные лаборатории	Н-1000
Горки SuperFrost Plus	ТермоФишер	99-910-01
Покровные стекла	ТермоФишер	Тел.: 12-553-454
Na фосфатный буфер одноосновной	сигма	С3139
Na фосфатный буфер двухосновной	сигма	С3264
Тритон Х 100	сигма	Х100-100мл
лак для ногтей	Услуги электронного микроскопа (EMS)	72180
Стереомикроскоп	Leica S6D со светодиодным источником света KL300
Тарелка на 9 лунок (точечная тарелка)	ВВР	89090-482
Nutator/Rocker	рыбак	22-363-152 или 88-861-041
Тарелка 35 мм	Дженеси Сайентиал	32-103
Сильгард	рыбак	Тел.: 50-366-794
Кимвайп	рыбак	06-666
Буферы потенциальной фиксации
Буфер PTN			0,1М NaPhosphate, pH 7,2, 0,1% Triton-X-100, обычно составляют 0,5 л 0,1M NaPhosphate буфера и алиquote 50 мл за раз по мере необходимости
Fly Stocks в Bloomington
elav (c155)-GAL4		БЛ458	Паннейрональный драйвер GAL4
w*;;; ОК107-ГАЛ4		БЛ 854	Драйвер GAL4 для всех нейронов тела гриба (вставка OK107-GAL4 находится на 4-й хромосоме)
y(1), w(67c23); c739-GAL4		BL 7362	Драйвер GAL4 для альфа- и бета-долей (на 2-й хромосоме)
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP		BL 64305	Драйвер GAL4 для альфа- и бета-долей, также содержит UAS-CD8-GFP
w*; 201Y-GAL4		БЛ 4440	Драйвер GAL4 в первую очередь для гамма-лепестков тела гриба (на 2-й хромосоме)
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS- CD8-GFP		BL 64296	Драйвер GAL4 для гамма-лепестков тела гриба, также содержит UAS-CD8-GFP