Индуцирование нейровоспаления у личинок данио-рерио с помощью инъекции липополисахарида

Аннотация

Источник: He, Y. et al. Микроинъекции липополисахарида в желудочки головного мозга личинкам данио-рерио для оценки нейровоспаления и нейротоксичности. J. Vis. Exp. (2022).

Видео демонстрирует микроинъекцию липополисахаридов (ЛПС) в мозг личинок данио-рерио, чтобы вызвать нейровоспаление. Личинки располагаются на чашке, выстланной агарозой, игла вводится в желудочки мозга, и вводится ЛПС. Введенный ЛПС запускает иммунный ответ, который приводит к нейровоспалению.

Протокол

1. Подготовка к микроинъекции

1. Подготовьтесь к инъекции, подтягивая стеклянные капилляры с помощью съемника микропипеток (см. Таблицу материалов), следуя пятиэтапному протоколу подтягивания стеклянной капиллярной трубки (Таблица 1).
2. Откройте кончик иглы (тонкостенные стеклянные капилляры [3,5 дюйма] с нитью, внешний диаметр [OD] 1,14 мм) до соответствующего размера под углом с помощью щипцов (рис. 1A).
3. Наполните иглу 0,1 мл минерального масла, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков.
4. Снимите завинчивающуюся крышку стальной иглы аппарата для микроинъекций. Совместите отверстие стеклянной иглы со стальной иглой, а затем затяните завинчивающуюся крышку. Установите аппарат для микроинъекций с заряженной иглой в микроманипулятор (см. Таблицу материалов).
5. Отрегулируйте положение аппарата для микроинъекций таким образом, чтобы микроманипулятор мог гибко перемещать аппарат под микроскопом. Выпустите определенный объем парафинового масла, чтобы стальная игла вошла в капиллярную стеклянную трубку.
6. Капните раствор для инъекций (например, 1× фосфатно-солевой буфер (PBS) или 5 мг/мл LPS) на предметное стекло, стерилизованное 70% этанолом, и отрегулируйте аппарат для микроинъекций так, чтобы наконечник был вставлен в каплю жидкости. Загрузите в иглу ~2 мкл раствора для инъекций.
7. Настройте микроманипулятор (точная настройка вверх, вниз, влево и вправо) так, чтобы кончик иглы аппарата для микроинъекций находился в том же поле зрения, что и личинки при большом увеличении (рис. 1B).

2. Крепление данио-рерио для микроинъекций

ПРИМЕЧАНИЕ: Развитие мозга рыбок данио-рерио происходит в течение 3 дней после оплодотворения (dpf) и созревает при 5 dpf с хорошо развитой центральной нервной системой. Таким образом, личинки 5 dpf уже пригодны для изучения LPS-опосредованного повреждения нейронов, а также поведенческих и воспалительных реакций.

1. Вводите личинкам данио рерио в течение примерно 30 минут после достижения интересующей стадии, чтобы поддерживать постоянство времени инъекции.
2. Чтобы обезболить личинок рыбок данио, смешайте трикаин с чистой водой аквариума (конечная концентрация 0,02% по сравнению с трикаином).
3. Растопите раствор 2% агарозы в воде двойной дистилляции (ddH₂O) с помощью микроволновой печи. Вылейте расплавленную агарозу в пластиковую посуду. Пластиковую посуду с 2% агарозным покрытием можно хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
4. Используйте пластиковую переводную пипетку для транспортировки личинок под наркозом к центру пластиковой посуды, покрытой 2% агарозой. Ориентируйте установленных личинок мозговой стороной вверх для доступа иглы.

3. Инъекция в желудочек мозга

1. Отрегулируйте увеличение микроскопа таким образом, чтобы структура желудочков головного мозга рыбок данио четко отображалась в поле зрения (рисунок 1B).
2. Осторожно поместите иглу над тектумом мозга (рисунок 1C).
3. Медленно проколите кожу мозга данио-рерио кончиком иглы с помощью микроманипулятора.
4. Нажмите ножную педаль, чтобы выпустить 1 нл 1x PBS или других концентраций LPS (1,0, 2,5 и 5,0 мг/мл) (см. Таблицу материалов). В качестве примера приведены изображения успешной инъекции желудочка головного мозга, при которой в желудочек мозга вводили 1 нл 1% синего красителя Эванса (разведенного в PBS) (рис. 1D). Сразу после инъекции переведите личинок в чистую яичную водную среду (Е3). Через 24 ч соберите личинок для микроскопической визуализации, поведенческого анализа локомотива и определения других показателей.

Результаты

Таблица 1: Пятиступенчатый протокол для вытягивания стеклянной капиллярной трубки.

...

шаг	Время работы (сек)	Уровень нагрева	действие
Т1	Л>	Н80-89	П1Л005
Т2	1.6-3	Н00

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
агароза	Сигма-Олдрич	А6361
Агароза, низкая температура желирования	Сигма-Олдрич	А9414
Drummond Nanoject III Программируемый нанолитровый инжектор	Друммонд Сайентифик	3-000-207 (Английский)
Флуоресцентные стереомикроскопы	Лейка	М205 ФА
Липополисахариды из Escherichia coli O111:B4	Сигма-Олдрич	Л3024
Ручной микроманипулятор	Мировые прецизионные приборы	М3301
нефтепродукт	Сигма-Олдрич	М5904
Фосфатно-солевой буфер	Сигма-Олдрич	П4417
Тонкостенные стеклянные капилляры (4") с нитью, наружный диаметр 1,5 мм	Мировые прецизионные приборы	ТВ150Ф-4
Трикаин (этиловый эфир 3-аминобензойной кислоты)	Сигма-Олдрич	А-5040