1. Подготовка к эксперименту
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие исходные растворы могут быть приготовлены и сохранены до использования.
- Раствор для вскрытия
- Растворите 3,62 г хлорида натрия (NaCl), 0,2 г хлорида калия (KCl), 0,069 г фосфата натрия (2PO4 ∙ H2O) и 1,306 г D-(+)-глюкозы в 500 мл дистиллированного H2O. Затем добавьте в раствор 12,5 мл буфера HEPES, 450 мкл раствора фенолового красного и 20 мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) фракции V. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью 1 Н гидроксида натрия (NaOH).
- Стерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм и хранить при температуре 4 °C. Это решение будет оставаться стабильным от одной недели до 10 дней.
- трипсин
- Приготовьте стоковый раствор в концентрации 25 г/л трипсина в 0,9% натрия хлорида. Хранить раствор при температуре -20 °C.
- Ингибитор трипсина
- Приготовьте бульон с концентрацией 10 мг/мл, растворив 1 г ингибитора трипсина куриного яичного белка в 100 мл 1 мМ HCl. Храните этот раствор при температуре -20 °С.
- Дезоксирибонуклеаза (ДНКаза)
- Растворите 100 мг ДНКазы 1 в 10 мл стерильной воды, чтобы получить запас 10 мг/мл. Хранить раствор при температуре -20 °C.
- MgSO4
- Добавьте 6,02 г сульфата магния (MgSO4) в 50 мл дистиллированной воды (H2O) для получения 1 М запаса. Хранить раствор при температуре 4 °C.
- CaCl2
- Растворите 0,735 г хлорида кальция (CaCl2∙2Н2О) в 50 мл дистиллированногоН2Одо исходной концентрации 100 мМ. Хранить раствор при температуре 4 °C.
- KCl
- Растворите 3,7275 г KCl в 50 мл дистиллированного H2O до исходной концентрации 1 М. Храните раствор при температуре 4 °C.
- D-(+)-глюкоза
- Растворите 1,802 г D-(+)-глюкозы в 50 мл дистиллированногоН2О до исходной концентрации 100 мМ. Хранить раствор при температуре 4 °C.
- Среды для клеточных культур
- Приготовьте среды для культивирования клеток следующим образом: 5 мл инактивированной при нагревании диализированной фетальной сыворотки крупного рогатого скота (E-MEM), 500 мкл 200 мкл L-глютамина, 100 мл 50 мг/мл гентамицина и 1 мл 1,0 М KCL следует добавить к 45 мл фильтрованной стерилизованной среды Eagle's minimal essential essential media (E-MEM), которая дополнена 1,125 г/л D-глюкозы для получения 50 мл питательных сред нейронов мозжечковой гранулы (CGN). Хранить среду при температуре 4 °C.
- Цитозин бета-D-арабино фуранозид
- Растворите 48 мг цитозина бета-D-арабино фуранозида в 10 мл питательной среды до исходной концентрации 20 мМ. Хранить раствор при температуре -20 °С.
- Поли-D-лизин
- Чтобы получить поли-D-лизин в концентрации 2 мг/мл, добавьте от 10 мл стерильного H2O до 20 мг поли-D-лизина. Исходный поли D-лизин следует хранить при -80 °C в 100 мкл аликвот.<бр/>
заметка: Следующие растворы должны быть приготовлены перед вскрытием и поддерживаться при температуре 4 °C до использования.
- MgSO4 Раствор для рассечения с добавкой
- Добавьте 300 мкл запасного MgSO4 к 250 мл диссекционного раствора.
- Раствор для диссекции трипсина
- Добавьте 100 мкл стокового трипсина и 12 мкл стокового MgSO4 в 10 мл диссекционного раствора.
- Раствор ингибитора трипсина 1
- Добавьте к 10 мл диссекционного раствора 164 мкл стокового ингибитора трипсина, 250 мкл стоковой ДНКазы 1 и 12 мкл стокового MgSO4.
- Раствор ингибитора трипсина 2
- Добавьте 1040 мкл стокового ингибитора трипсина, 750 мкл стоковой ДНКазы 1 и 12 мкл стокового раствора MgSO4 к 10 мл диссекционного раствора.
- CaCl2 с добавкой диссекционного раствора
- Добавьте 10 μЛ запасного CaCl2 и 25 μЛ запасного MgSO4 к 10 мл диссекционного раствора.
- Чашки для культур, покрытые поли-D-лизином
- Для покрытия посуды для культивирования разведите 100 мкл бульонного поли-D-лизина в 40 мл стерильногоН2О. Для посуды для культуры Nunc 35 мм добавьте 2 мл разбавленного раствора поли D-лизина. Для 4-луночных планшетов добавьте 300 μL разбавленного поли-D-лизина в каждую лунку.
- Дайте поли-D-лизину постоять в течение 1 ч перед аспирацией и промывкой каждой лунки 4 мл или 600 мкл (для культуральных чашек 35 мм или 4-луночных планшетов соответственно) стерильного H2O. Затем отсадите H2O и дайте посуде высохнуть на воздухе в течение 1 часа.
2. Извлечение мозга и выделение мозжечка
- Обезглавьте 6–7-дневного щенка мыши с помощью ножниц для обезглавливания. Проводят вскрытие головного мозга в капюшоне для стерильной культуры тканей.
- Чтобы удалить мозг, захватите голову с помощью щипцов и разрежьте кожу по направлению к передней части головы с помощью ножниц для микродиссекции, как показано на рисунке 1. Затем разрежьте кость черепа с помощью новых ножниц, чтобы свести к минимуму риск загрязнения. Удалите череп, покрывающий мозг, с помощью щипцов и вытащите мозг с помощью щипцов или шпателя.
- При необходимости перережьте зрительный нерв, чтобы облегчить вывод мозга целиком.
- Поместите мозг в раствор для вскрытия, который дополнен MgSO4. Держите раствор и мозг на льду.
- После удаления мозга под диссекционным микроскопом отделите мозжечок от мозга, еще находясь в диссекционном растворе, дополненном MgSO4, и удалите мозговые оболочки с помощью тонких щипцов. Поверните мозжечок на его вентральную сторону и обеспечьте удаление сосудистого сплетения.
- Слейте мозжечок в 35-миллиметровую чашку, содержащую ~1 мл диссекционного раствора с добавлением MgSO4.
- Измельчите ткань на мелкие кусочки и переложите в пробирку объемом 50 мл, содержащую 30 мл буферного раствора для диссекции MgSO4.
3. Выделение и культивирование нейронов гранул мозжечка
мыши
- Центрифугируйте пробирку объемом 50 мл, содержащую измельченную мозговую ткань, в течение 5 мин при температуре 644 x g и 4 °C.
- Удалите надосадочную жидкость и добавьте 10 мл раствора для диссекции трипсина. Затем встряхивайте пробирку на высокой скорости в течение 15 минут при температуре 37 °C.
- Добавьте в пробирку 10 мл раствора ингибитора трипсина 1 и осторожно покачивайте в течение 2 минут.
- Центрифугируйте пробирку в течение 5 минут при 644 x g и 4 °C.
- Удалите надосадочную жидкость и добавьте 2 мл раствора ингибитора трипсина 2, а затем переложите в пробирку объемом 15 мл.
- Растирайте ткань в пробирке объемом 15 мл до тех пор, пока раствор не станет мутным. Затем дайте отстояться в течение 5 минут.
- Удалите прозрачную надосадочную жидкость и переложите надосадочную жидкость в новую пробирку, содержащую 1 мл диссекционного раствора с добавлением CaCl2.
- Добавьте еще один мл раствора ингибитора трипсина 2 на дно пробирки, содержащей гранулу, начиная с шага 3.6. Еще раз разотрите и дайте отстояться в течение 5 минут. Извлеките надосадочную жидкость и добавьте ее в пробирку, содержащую надосадочную жидкость, начиная с шага 3.7 (это повторение шагов 3.6-3.7). Повторяйте этот процесс до тех пор, пока большая часть ткани не будет механически диссоциирована.
- Добавьте 0,3 мл дополненного диссекционного раствора CaCl2 в сбор надосадочной жидкости на каждый мл надосадочной жидкости.
- Смешайте содержимое пробирки, а затем центрифугируйте в течение 5 минут при 644 х г.
- Удалите надосадочную жидкость и добавьте в гранулу 10 мл свежей среды и перемешайте.
- Затем клетки могут быть подсчитаны и разбавлены до концентрации 1,5 x 106 клеток/мл. Обратите внимание, что в целом ожидается 10 миллионов клеток от каждого рассекаемого мозга, в зависимости от времени трипсинизации и эффективности вскрытия. Пластинчатые ячейки на ранее изготовленных поли D-лизиновых пластинах. Для 4-луночных планшетов прокладывают 0,5 мл, давая 7,5 х 10по 5 клеток на лунку. Для 35-мм посуды, тарелку 4 мл, давая 6 х 10по 6 ячеек на тарелку.
- Через 24 ч добавьте в планшеты цитозин-β-арабинофуранозид (AraC) для уменьшения глиального загрязнения. На каждый мл среды требуется 0,5 мкл 20 мМ AraC. Добавление AraC не требует смены носителя. Если клетки должны сохраняться в течение 7-8 дней, повторите эту обработку на 3-й день.
- Поддерживайте культуры в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C и скармливайте 100 мкл 100 мл глюкозы, добавляемой в культуру, на каждые 2 мл среды каждые 2 дня в течение 5 дней. Полная смена носителя не требуется.
4. Моделирование повреждения нейронов
- Чтобы вызвать АФК-индуцированную гибель клеток (окислительный стресс), обрабатывайте нейроны перекисью водорода в дозе 75-100 мкМ (H2O2) и переходите на кондиционированные среды из параллельных культур после 5 минут воздействия H2O2. Обратите внимание, что из-за нестабильностиH2O2 оптимизируйте концентрацию до уровня, который вызывает 50-70% гибель клеток в культуре после 24 ч обработки (рис. 2).
