Моделирование индуцированной активными формами кислорода гибели нейронов в гранулярных нейронах мозжечка мышей

1. Подготовка к эксперименту

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие исходные растворы могут быть приготовлены и сохранены до использования.

1. Раствор для вскрытия
   1. Растворите 3,62 г хлорида натрия (NaCl), 0,2 г хлорида калия (KCl), 0,069 г фосфата натрия (₂PO₄ ∙ H₂O) и 1,306 г D-(+)-глюкозы в 500 мл дистиллированного H₂O. Затем добавьте в раствор 12,5 мл буфера HEPES, 450 мкл раствора фенолового красного и 20 мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) фракции V. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью 1 Н гидроксида натрия (NaOH).
   2. Стерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм и хранить при температуре 4 °C. Это решение будет оставаться стабильным от одной недели до 10 дней.
2. трипсин
   1. Приготовьте стоковый раствор в концентрации 25 г/л трипсина в 0,9% натрия хлорида. Хранить раствор при температуре -20 °C.
3. Ингибитор трипсина
   1. Приготовьте бульон с концентрацией 10 мг/мл, растворив 1 г ингибитора трипсина куриного яичного белка в 100 мл 1 мМ HCl. Храните этот раствор при температуре -20 °С.
4. Дезоксирибонуклеаза (ДНКаза)
   1. Растворите 100 мг ДНКазы 1 в 10 мл стерильной воды, чтобы получить запас 10 мг/мл. Хранить раствор при температуре -20 °C.
5. MgSO₄
   1. Добавьте 6,02 г сульфата магния (MgSO₄) в 50 мл дистиллированной воды (H₂O) для получения 1 М запаса. Хранить раствор при температуре 4 °C.
6. CaCl₂
   1. Растворите 0,735 г хлорида кальция (CaCl₂∙_2Н2О) в 50 мл дистиллированного_Н2Одо исходной концентрации 100 мМ. Хранить раствор при температуре 4 °C.
7. KCl
   1. Растворите 3,7275 г KCl в 50 мл дистиллированного H₂O до исходной концентрации 1 М. Храните раствор при температуре 4 °C.
8. D-(+)-глюкоза
   1. Растворите 1,802 г D-(+)-глюкозы в 50 мл дистиллированного_Н2О до исходной концентрации 100 мМ. Хранить раствор при температуре 4 °C.
9. Среды для клеточных культур
   1. Приготовьте среды для культивирования клеток следующим образом: 5 мл инактивированной при нагревании диализированной фетальной сыворотки крупного рогатого скота (E-MEM), 500 мкл 200 мкл L-глютамина, 100 мл 50 мг/мл гентамицина и 1 мл 1,0 М KCL следует добавить к 45 мл фильтрованной стерилизованной среды Eagle's minimal essential essential media (E-MEM), которая дополнена 1,125 г/л D-глюкозы для получения 50 мл питательных сред нейронов мозжечковой гранулы (CGN). Хранить среду при температуре 4 °C.
10. Цитозин бета-D-арабино фуранозид
    1. Растворите 48 мг цитозина бета-D-арабино фуранозида в 10 мл питательной среды до исходной концентрации 20 мМ. Хранить раствор при температуре -20 °С.
11. Поли-D-лизин
    1. Чтобы получить поли-D-лизин в концентрации 2 мг/мл, добавьте от 10 мл стерильного H₂O до 20 мг поли-D-лизина. Исходный поли D-лизин следует хранить при -80 °C в 100 мкл аликвот.<бр/> заметка: Следующие растворы должны быть приготовлены перед вскрытием и поддерживаться при температуре 4 °C до использования.
12. MgSO₄ Раствор для рассечения с добавкой
    1. Добавьте 300 мкл запасного MgSO₄ к 250 мл диссекционного раствора.
13. Раствор для диссекции трипсина
    1. Добавьте 100 мкл стокового трипсина и 12 мкл стокового MgSO₄ в 10 мл диссекционного раствора.
14. Раствор ингибитора трипсина 1
    1. Добавьте к 10 мл диссекционного раствора 164 мкл стокового ингибитора трипсина, 250 мкл стоковой ДНКазы 1 и 12 мкл стокового MgSO₄.
15. Раствор ингибитора трипсина 2
    1. Добавьте 1040 мкл стокового ингибитора трипсина, 750 мкл стоковой ДНКазы 1 и 12 мкл стокового раствора MgSO₄ к 10 мл диссекционного раствора.
16. CaCl₂ с добавкой диссекционного раствора
    1. Добавьте 10 μЛ запасного CaCl₂ и 25 μЛ запасного MgSO₄ к 10 мл диссекционного раствора.
17. Чашки для культур, покрытые поли-D-лизином
    1. Для покрытия посуды для культивирования разведите 100 мкл бульонного поли-D-лизина в 40 мл стерильного_Н2О. Для посуды для культуры Nunc 35 мм добавьте 2 мл разбавленного раствора поли D-лизина. Для 4-луночных планшетов добавьте 300 μL разбавленного поли-D-лизина в каждую лунку.
    2. Дайте поли-D-лизину постоять в течение 1 ч перед аспирацией и промывкой каждой лунки 4 мл или 600 мкл (для культуральных чашек 35 мм или 4-луночных планшетов соответственно) стерильного H₂O. Затем отсадите H₂O и дайте посуде высохнуть на воздухе в течение 1 часа.

2. Извлечение мозга и выделение мозжечка

1. Обезглавьте 6–7-дневного щенка мыши с помощью ножниц для обезглавливания. Проводят вскрытие головного мозга в капюшоне для стерильной культуры тканей.
2. Чтобы удалить мозг, захватите голову с помощью щипцов и разрежьте кожу по направлению к передней части головы с помощью ножниц для микродиссекции, как показано на рисунке 1. Затем разрежьте кость черепа с помощью новых ножниц, чтобы свести к минимуму риск загрязнения. Удалите череп, покрывающий мозг, с помощью щипцов и вытащите мозг с помощью щипцов или шпателя.
   1. При необходимости перережьте зрительный нерв, чтобы облегчить вывод мозга целиком.
3. Поместите мозг в раствор для вскрытия, который дополнен MgSO₄. Держите раствор и мозг на льду.
4. После удаления мозга под диссекционным микроскопом отделите мозжечок от мозга, еще находясь в диссекционном растворе, дополненном MgSO₄, и удалите мозговые оболочки с помощью тонких щипцов. Поверните мозжечок на его вентральную сторону и обеспечьте удаление сосудистого сплетения.
5. Слейте мозжечок в 35-миллиметровую чашку, содержащую ~1 мл диссекционного раствора с добавлением MgSO₄.
6. Измельчите ткань на мелкие кусочки и переложите в пробирку объемом 50 мл, содержащую 30 мл буферного раствора для диссекции MgSO₄.

3. Выделение и культивирование нейронов гранул мозжечка

1. Центрифугируйте пробирку объемом 50 мл, содержащую измельченную мозговую ткань, в течение 5 мин при температуре 644 x g и 4 °C.
2. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 10 мл раствора для диссекции трипсина. Затем встряхивайте пробирку на высокой скорости в течение 15 минут при температуре 37 °C.
3. Добавьте в пробирку 10 мл раствора ингибитора трипсина 1 и осторожно покачивайте в течение 2 минут.
4. Центрифугируйте пробирку в течение 5 минут при 644 x g и 4 °C.
5. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 2 мл раствора ингибитора трипсина 2, а затем переложите в пробирку объемом 15 мл.
6. Растирайте ткань в пробирке объемом 15 мл до тех пор, пока раствор не станет мутным. Затем дайте отстояться в течение 5 минут.
7. Удалите прозрачную надосадочную жидкость и переложите надосадочную жидкость в новую пробирку, содержащую 1 мл диссекционного раствора с добавлением CaCl₂.
8. Добавьте еще один мл раствора ингибитора трипсина 2 на дно пробирки, содержащей гранулу, начиная с шага 3.6. Еще раз разотрите и дайте отстояться в течение 5 минут. Извлеките надосадочную жидкость и добавьте ее в пробирку, содержащую надосадочную жидкость, начиная с шага 3.7 (это повторение шагов 3.6-3.7). Повторяйте этот процесс до тех пор, пока большая часть ткани не будет механически диссоциирована.
9. Добавьте 0,3 мл дополненного диссекционного раствора CaCl₂ в сбор надосадочной жидкости на каждый мл надосадочной жидкости.
10. Смешайте содержимое пробирки, а затем центрифугируйте в течение 5 минут при 644 х г.
11. Удалите надосадочную жидкость и добавьте в гранулу 10 мл свежей среды и перемешайте.
12. Затем клетки могут быть подсчитаны и разбавлены до концентрации 1,5 x 10⁶ клеток/мл. Обратите внимание, что в целом ожидается 10 миллионов клеток от каждого рассекаемого мозга, в зависимости от времени трипсинизации и эффективности вскрытия. Пластинчатые ячейки на ранее изготовленных поли D-лизиновых пластинах. Для 4-луночных планшетов прокладывают 0,5 мл, давая 7,5 х 10^{по 5} клеток на лунку. Для 35-мм посуды, тарелку 4 мл, давая 6 х 10^{по 6} ячеек на тарелку.
13. Через 24 ч добавьте в планшеты цитозин-β-арабинофуранозид (AraC) для уменьшения глиального загрязнения. На каждый мл среды требуется 0,5 мкл 20 мМ AraC. Добавление AraC не требует смены носителя. Если клетки должны сохраняться в течение 7-8 дней, повторите эту обработку на 3-й день.
14. Поддерживайте культуры в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 при температуре 37 °C и скармливайте 100 мкл 100 мл глюкозы, добавляемой в культуру, на каждые 2 мл среды каждые 2 дня в течение 5 дней. Полная смена носителя не требуется.

4. Моделирование повреждения нейронов

1. Чтобы вызвать АФК-индуцированную гибель клеток (окислительный стресс), обрабатывайте нейроны перекисью водорода в дозе 75-100 мкМ (H₂O₂) и переходите на кондиционированные среды из параллельных культур после 5 минут воздействия H₂O₂. Обратите внимание, что из-за нестабильности_H2O₂ оптимизируйте концентрацию до уровня, который вызывает 50-70% гибель клеток в культуре после 24 ч обработки (рис. 2).

Рисунок 1: Удаление мозга мыши и вскрытие мозжечка. (А) Чтобы извлечь мозг мыши в возрасте 6-7 дней, с помощью щипцов возьмите голову и разрежьте кожу спереди по пунктирным линиям с помощью ножниц для микродиссекции. Будьте осторожны и режьте только кожу и соединительную ткань, слишком глубокий разрез может проколоть череп и повредить мозг. Эти три разреза, прямые по средней линии, и два изогнутых латерально, позволяют отодвинуть кожу назад, обнажая череп. После обнажения череп может быть пронзен кончиком ножниц и разрезан спереди. Необходимо соблюдать большую осторожность, чтобы не повредить мозжечок, чтобы облегчить идентификацию и удаление мозговых оболочек. После разрезания щипцы могут быть использованы для снятия черепа, обнажая мозг, который затем может быть выведен в прохладный раствор для вскрытия с помощью пары щипцов или шпателя. Для того, чтобы удалить мозг, возможно, потребуется перерезать зрительный нерв. (B) После удаления из черепа мозговые оболочки должны быть удалены из мозжечка с помощью пары щипцов с тонкими наконечниками. (C) С помощью пары щипцов с тонкими наконечниками мозжечок отделяется от оставшейся ткани и осматривается, чтобы обеспечить полное удаление мозговых оболочек.

Рисунок 2: Моделирование повреждения нейронов в гранулярных нейронах мозжечка. Изолированные мозжечки у мышей 6-7-го дня диссоциируют на одиночные клетки в соответствии с процедурой, представленной в части 3. После диссоциации клетки подсчитывают и ресуспендируют в объеме питательной среды для получения 1,5 x 106 клеток/мл. Для 35 мм тарелок наносят 4 мл, что дает 6 x 106 клеток на планшет. Для визуализационных стекол наносится 0,5 мл пластин, что дает 7,5 x 105 клеток/лунку. Затем CGN могут быть трансдуцированы лентивирусом или инфицированы аденовирусом. Использование аденовируса в день осаждения (0 дней in vitro (DIV)) дает эффективность трансфекции более 90% и позволяет изучать повреждение нейронов в результате окислительного стресса и повреждения ДНК. Добавление 10 мкМ камптотекина (CPT) вызывает повреждение ДНК, в то время как 75-100 мкМ перекиси водорода (H2O2) вызывает окислительный стресс. КонцентрацияH2,O2 должна быть оптимизирована таким образом, чтобы вызвать 50% гибель клеток через 24 часа. Заражение аденовирусами при 5 DIV дает более низкую эффективность трансдукции, составляющую менее 10%. При 7 DIV, когда NMDA-рецепторы обогащаются в культуре, нейроны могут быть обработаны 100 мкМ NMDA и 10 мкМ глицином для индуцирования эксайтотоксичности. Это идеально подходит для последующего анализа визуализации или трассировки одного нейрона. Наконец, трансдуцирование лентивирусом при 0 DIV с последующей обработкой 100 мкМ NMDA и 10 мкМ глицином при 7 DIV дает достаточно высокую эффективность трансдукции (>80%), что позволяет проводить биохимический анализ культуры, включая секвенирование ChIP, изучение экспрессии белка и проведение анализов живых/мертвых веществ.