$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Иммуногистохимия
- Окрашивание аналогом тимидина
- Поместите срезы ткани в PBS (фосфатно-солевой буфер) и установите 5−8 срезов на положительно заряженное предметное стекло, сохраняя последовательный порядок от переднего к заднему и ту же ориентацию. Дайте срезам ткани высохнуть, чтобы они полностью прилипли к предметным стеклам, а затем нарисуйте границу с помощью гидрофобной ручки или ручки ПАП.
- Пермеабилизируйте срезы пермеабилизационным буфером (0,5% TBS (трис буферизованный физиологический раствор)-тритон) в течение 20−30 мин. Затем промыть секции 2 раза с помощью TBS-triton по 5 мин.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Пермеабилизация способствует проникновению внутриклеточных антител. Время пермеабилизации может быть скорректировано в зависимости от толщины ткани и эффективности антител. В качестве альтернативы можно увеличить концентрацию детергента для повышения пермеабилизирующей активности. Тем не менее, следует соблюдать осторожность, чтобы не пеабилизировать слишком долго, так как хрупкость тканей увеличивается с увеличением времени пермеабилизации.
- Приготовьте реакционный раствор Edu (5-этинил-2'-дезоксиуридин) в соответствии с таблицей 1. Конечная концентрация Alexa488-азида составляет 15 мкМ в 1 мл реакционного раствора Edu.
- Инкубируйте срезы в реакционном растворе Edu в течение от 30 минут до 1 часа, а затем промойте 3 раза в TBS-тритоне в течение 5 минут каждый. После этого шага закройте горки алюминиевой фольгой, чтобы защитить их от света. На этом этапе проверьте, работает ли реакция Edu с помощью флуоресцентного микроскопа. Клетки, меченные Edu, будут флуоресцировать под эпифлуоресцентным микроскопом.
- Протокол смонтированного среза ткани
- Блокируйте срезы ткани, установленные на предметном стекле, начиная с шага 1.1.4, с использованием блокирующего буфера, выращенного у тех же животных, что и вторичное антитело, например, сыворотку осла, в течение 30 мин - 1 ч, а затем промывайте 2 раза в TBS-тритоне в течение 5 мин каждый.
- Готовьте раствор первичного антитела (т.е. куриного анти-нестина) на стадии блокирования, смешивая первичные антитела в блокирующем буферном растворе в соотношении 1:200. 250 мкл на предметное стекло достаточно для полного погружения ткани в раствор
.
- Инкубируйте срезы тканей в растворе первичного антитела в течение ночи в режиме ЛТ после блокировки смываний. Измените этот шаг в зависимости от используемого основного антитела.
заметка: Если антитела имеют высокий фон или неспецифическое связывание, инкубация при 4 °C вместо RT (комнатной температуры) может улучшить результаты. При необходимости антитела с плохим проникновением в ткани можно оставить для инкубации на 2 дня.
- Инкубируйте срезы ткани 3 раза в TBS-тритоне в течение 5 мин для удаления избытка первичного антитела. Затем инкубируют срезы тканей в флуорконъюгированных вторичных антителах (например, Alexa 647 anti-chicken в 1:200), приготовленных в блокирующем буферном растворе в течение 2 ч в режиме ЛТ.
- Инкубируйте срезы ткани 3 раза в TBS-тритоне в течение 5 мин для удаления избытка вторичного антитела и применяйте 300 мкМ раствор DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) в соотношении 1:100 в PBS в течение 15 мин в режиме ЛТ.
- Инкубируйте срезы ткани 3 раза в PBS в течение 5 минут, чтобы удалить излишки DAPI, и удалите круг пап-ручки вокруг ткани с помощью ватного тампона или деликатной рабочей салфетки. Дайте секциям высохнуть, а затем нанесите монтажный носитель и покровное покрытие. Дайте монтажному носителю высохнуть перед съемкой слайдов.
Таблица 1: Растворы, используемые для иммуногистохимии
| Антифриз | Этиленгликоль 150 мл + сахароза 150 г + заливка до 500 мл 0,1 М ПБ на 500 мл раствора |
| Цитратный буфер | 9 мл запаса лимонной кислоты + 41 мл буфера три-натрия цитрата + 450 мл ddH2O |
| Бульон лимонной кислоты | [0.1 М] Лимонная кислота 21 г/1 л ddH2O |
| Бульон из цитрата тринатрия | [0,1 М] Тринатрия цитрат 29,4 г/1 л ddH2O |
| Трис буферизированный физиологический раствор -Тритон (TBS -Тритон) | 0,05% 100-кратный Тритон в TBS |
| Буфер пермеабилизации | 0,5% 100-кратный Тритон в TBS |
| Блокирующий буфер | 0,33 мл сыворотки осляка в 10 мл TBS-Triton |
| Решение Edu Reaction | Приготовьте раствор CuSO4·5H2O, добавив 1 мг CuSO4·5H2O в 4 мл раствора [0,1 M] Tris pH 8,5. Затем добавьте 1:40 600 μМ раствора Alexa488-азида и 10 мг/мл L-Na+ аскорбата в раствор CuSO4·5H2O перед нанесением его на ткань. |