$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Поддержание культуры микроглиальных клеток
- Теплая среда для культивирования клеток (модифицированная среда Dulbecco's Modified; DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина/неомицина (PSN) до 37 °C.
- Получить замороженный запас микроглиальных клеток BV2 на пассаже 18 - 25 из хранилища при -80 °С. Быстро разморозить клетки на водяной бане при температуре 37 °С.
- Аккуратно перенесите клетки в вентилируемую колбу размером 75 см2 с 10 мл клеточной питательной среды.
- Инкубируйте колбу с 5%СО2 при 37 °C. Отсаживайте среду через 24 часа и заменяйте свежей средой. Выращивайте клетки примерно до 70 - 80% конфлюенции.
2. Подсчет и покрытие ячеек
- На водяной бане при температуре 37 °C подогреть DMEM и 1x раствор трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
- Аспиратуйте среду из клеток и добавьте 500 мкл трипсина. Выдерживать при температуре 37°C в течение 2 - 5 минут.
- С помощью скребка извлеките ячейки из колбы и суспензируйте в 5 мл DMEM. Пропустите клетки через ситечко 70 мкм в пробирку объемом 50 мл три раза.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и засейте 8000 клеток/лунку в прозрачную нижнюю пластину с черными стенками в конечном объеме 200 мкл DMEM с добавлением 10% FBS и 1% PSN. Инкубировать в 5%CO2 при 37 °C в течение 24 часов.
- Удалите старый DMEM и замените его 200 μл подогретого DMEM с добавлением 1% PSN для истощения микроглии в сыворотке. Инкубировать в 5%CO2 при 37 °C в течение 24 часов.
3. Активация микроглии
- В отдельных пробирках разбавляют наночастицы серебра (AgNPs) (0,01, 0,05 или 0,1 мкг/мл) и носитель/нейтральный контроль (цитрат натрия, 0,04 мМ) в бессывороточном DMEM с добавлением 1% PSN до конечных рабочих концентраций.
- Удалите по 100 мкл среды из каждой лунки и замените 100 мкл соответствующего лечебного состава.
- Инкубировать в 5 %CO2 при 37 °C в течение 24 часов.
4. Фильтрация кондиционированных сред
- Соберите 200 мкл надосадочной жидкости из каждой лунки и перенесите ее в фильтр (молекулярная отсечка 10 кДа) с собирательной трубкой (емкостью от 1,5 до 2 мл).
- Центрифуга при 14 000 x g при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Откажитесь от проточного (надосадочного вещества с частицами) и поместите фильтр вверх дном в новую сборную трубку.
- Центрифуга при 1 000 x g при комнатной температуре в течение 2 мин.<бр/>
заметка: Полученная отфильтрованная среда (содержащая секретируемые цитокины) концентрируется в шесть раз.
- Доведите объем концентрата до 400 мкл со свежим DMEM с добавлением 10% FBS и 1% PSN и храните на льду.
5. Поддержание культуры клеток гипоталамуса
- Теплая среда для культивирования клеток DMEM с добавлением 10% FBS и 1% PSN до 37 °C.
- Получить замороженный запас клеток гипоталамуса (mHypo-A1/2) при пассаже 18 - 25 при температуре 80 °С. Быстро разморозить клетки на водяной бане при температуре 37 °С.
- Аккуратно перенесите клетки в вентилируемую колбу размером 75 см2 с 10 мл клеточной питательной среды.
- Инкубируйте колбу с 5%СО2 при 37 °C. Отсаживайте среду через 24 часа и заменяйте свежей средой. Выращивайте клетки до тех пор, пока они не достигнут примерно 70 - 80% слияния.
6. Определение токсичности клеток гипоталамуса
- Подогрейте раствор DMEM и 1x-trypsin-EDTA на водяной бане при температуре 37 °C.
- Аспиратируйте среду из клеток гипоталамуса и добавьте 500 мкл трипсина. Выдерживать при 37 °C в течение 2 - 5 минут. Удалите ячейки из колбы с помощью скребка, как описано выше в шаге 2.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и пластинчатых гипоталамических клеток с концентрацией 5000 клеток/лунку в прозрачной нижней пластине с черными стенками в конечном объеме 200 мкл DMEM с добавлением 10% FBS и 1% PSN, и инкубируйте в течение ночи с 5%CO2 при 37 °C.
- Удалите 100 мкл старой среды с помощью многоканального дозатора и добавьте 100 мкл отфильтрованной концентрированной кондиционированной среды до конечной концентрации 1x.
- Инкубировать в 5%CO2 при 37 °C в течение 24 часов.
- Добавьте 22 μл реагента резазурина и инкубируйте в течение 20 мин в 5%CO2 при 37 °C.
- Используя многомодовый спектрофотометр, зарегистрируйте флуоресценцию (560 нм EX/590 нм ЭМ) для измерения жизнеспособности клеток. Отчет о результатах в виде относительных единиц флуоресценции (RFU).