1. Подготовка реагентов и оборудования
- Приготовьте 1x диссекционный буфер (70 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 0,02 мМ CaCl2, 20 мМ MgCl2, 10 мМ NaHCO3, 115 мМ сахарозы, 5 мМ трегалозы, 5 мМ гидроксиэтилпиперазина этансульфоновой кислоты [HEPES]; pH 7,2).
- Приготовьте 1x фосфатно-солевой буфер (PBS).
- Приготовьте 1x PBT, используя 1x PBS с 0,01% Triton X-100.
- Приготовьте агаровые пластины из фруктового сока.14 Кратко смешайте 30 г агара с 700 мл H2O и автоклав. Растворите 0,5 г метилпарабена в 10 мл этанола и добавьте раствор в 300 мл концентрата фруктового сока (виноградного или яблочного). Смешайте концентрат с автоклавным раствором агара и разлейте по крышкам чашек Петри размером 10 мм х 35 мм.<бр />
заметка: Премикс для виноградного агара также можно приобрести в различных компаниях (см. Таблицу материалов).
- Приобретите щипцы размера 5, позволяющие механически травмировать личинок.
- Используйте стандартный аппарат для анестезии на основе дрозофилы CO2.
2. Отбор личинок дрозофилы
- Возьмите флакон или флакон с дрозофилой, содержащей блуждающих личинок третьего возраста, которые были культивированы при 25 °C.
- Выберите десять отдельных личинок 2-го или 3-го возраста в зависимости от внешнего вида. Личинки третьего возраста могут быть идентифицированы по внешнему виду передних разветвленных дыхальцев, в то время как личинки второго возраста меньше и имеют более булавовидные передние дыхальца.
заметка: Личичиночные стадии также можно определить по времени. При 25 °C личинки второго возраста появляются примерно через 48 ч после вылупления, а личинки третьего возраста линяют примерно через 24 ч. Если вас интересует изучение нейродегенерации в NMJ, личинки второго возраста должны быть повреждены.
3. Подготовка личинок дрозофилы к механической травме
- Аккуратно подбирайте отдельные личинки с помощью щипцов или кисти, стараясь ни в коем случае не сдавливать их.
- Поместите десять личинок непосредственно в стеклянную чашку с холодным 1X PBS или буфером для препарирования, чтобы удалить остатки пищи и замедлить подвижность личинок.
4. Механическая травма и лечение личинок дрозофилы
- Поместите каждую отдельную личинку на аппарат для обезболивания CO2.
- Под рассекающим микроскопом осторожно переверните каждую личинку на спинную сторону, чтобы визуализировать сегментарные нервы через кутикулу.
- Положение щипцов размера 5 примерно от 1/2 до 2/3 вниз по длине личинки, начиная с крюков для рта. После этого зажмите примерно 1/3 вентральной кутикулы, содержащей сегментарные нервы, щипцами размера 5.
- Чтобы обеспечить повреждение сегментарных нервов личинок, приложите достаточную силу, чтобы раздавить сегментарные нервы, но оставьте кутикулу нетронутой. Чтобы определить правильное количество силы, раздавите 10 личинок и убедитесь, что смертность через 5 ч ниже 50%.
- После травмы осторожно переложите личинок на агаровую пластину с фруктовым соком, содержащую примерно 0,5 г дрожжевой пасты. Поместите каждую личинку так, чтобы ее передний конец находился на дрожжевой пасте, для продолжения питания, несмотря на нарушение подвижности.
заметка: Чтобы убедиться в том, что личиночные сегментарные нервы были повреждены, после переноса на агаровую пластину может наблюдаться нарушенная подвижность личинок. Раненые личинки фактически парализованы позади места повреждения, но все еще могут двигать своими крючками рта и кормом. Высокая смертность животных после травм является обычным явлением, поэтому лучше всего травмировать на 20-50% больше животных, чем необходимо для эксперимента.
- Поместите агаровые пластины с дрожжевой пастой и 10 ранеными личинками на дно пустой чашки Петри размером 100 х 15 мм. Накройте эту пластину Петри, в которой теперь находятся раненые личинки на агаровой пластине, влажным бумажным полотенцем, следя за тем, чтобы бумажное полотенце не касалось личинок или пластин агара. Поместите эту чашку Петри в большую герметичную емкость при комнатной температуре (RT).
- Извлекайте личинки для вскрытия через определенные периоды времени (6, 12 или 24 часа) после травмы.
заметка: Чтобы изучить непосредственное воздействие травмы на аксональный цитоскелет, личинки могут быть вскрыты сразу после травмы. Для изучения дефектов аксонального транспорта личинки могут быть препарированы примерно через 6 ч после травмы. Примерно через 12 ч после травмы может наблюдаться накопление убиквитинированных белков, а через 24 ч после травмы может наблюдаться дегенерация моторных нейронов в NMJ.