Генерация экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита на мышиной модели

Abstract

Источник: Tietz, S. M. et al. Визуализация нарушения эндотелиального и глиального барьеров нейроваскулярного блока при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите in vivo. J. Vis. Exp.(2019)

Это видео демонстрирует метод индуцирования экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE) путем введения пептидов, полученных из миелина, с адъювантом для активации аутореактивных Т-клеток, которые мигрируют в мозг. Коклюшный токсин вводится для повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера, позволяя этим Т-клеткам и другим иммунным клеткам проникать в мозг. Эти иммунные клетки вызывают демиелинизацию, что приводит к нарушению нервной передачи и развитию EAE.

Protocol

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Индукция EAE

1. Обезболить мышей C57BL/6 изофтораном с помощью системы испарителя. Чтобы вызвать анестезию у мышей, подвергните мышь воздействию 4,5% изофторана в кислороде в небольшой инкубационной камере, прежде чем переложить мышь на лицевую маску с 2,1% изофторана. Используйте анестезиологическую установку, оснащенную грелкой, чтобы предотвратить переохлаждение мыши.
2. Зафиксируйте мышь, находящуюся под наркозом, в одну руку и сначала введите 30 мкл миелина олигодендроцитарного гликопротеина (MOG)-пептида aa_35-55 (MOG_35-55)/ полного адъюванта Фрейнда (CFA)-эмульсии подкожно в боковые края задних ног (рис. 1: 1 + 2; всего 60 мкл; левый фланг 30 мкл и правый фланг 30 мкл) в непосредственной близости от паховых лимфатических узлов.
3. Положите мышь на живот и введите 20 μL эмульсии MOGaa_35-55/CFA в левую и правую мягкие жировые ткани у корня хвоста (Рисунок 1: 3 + 4; всего 40 μл; левый боковой корень хвоста 20 μL и правый боковой корень хвоста 20 μл) и немного капли эмульсии MOGaa_35-55/CFA в шею мыши (Рисунок 1: пункт 5).
4. Введите мышь 100 μл раствора коклюшного токсина (ПТх) внутрибрюшинно. Держите голову мыши ниже центра тела, чтобы избежать инъекции в кишечник.
5. Замените поддерживающий рацион (экструдат основных питательных веществ: сырой белок 18,5%; сырой жир 4,5%; сырая клетчатка 4,5%; сырая зола 6,5%; крахмал 35%; метаболическая энергия: 13,1 МДж/кг) на рацион разведения (экструдат основных питательных веществ: сырой белок 23,5%; сырой жир 5,5%; сырая клетчатка 3%; сырая зола 5,7%; крахмал 36%; метаболическая энергия: 14,3 МДж/кг) с целью обеспечения мышей пищей с более высоким содержанием энергии до и во время ожидаемого клинического заболевания.
6. Снимите маску для лица и переложите мышь в домашнюю клетку с помощью грелки. Через 10 минут убедитесь, что мышь полностью проснулась и подвижна.
7. Повторите инъекцию PTx (шаг 1.4) через 48 часов после первой процедуры.

2. Оценка мышей EAE

1. Проверяйте состояние здоровья мышей EAE каждое утро, заглядывая внутрь клеток.
2. Оценивайте мышей EAE каждый день.
3. Выньте каждую отдельную мышь, участвующую в эксперименте EAE, из клетки и проверьте, есть ли у хвоста тонус, переместив его пальцем вверх. Здоровая мышь будет держать хвост поднятым (хвост имеет тонус). Если началось клиническое ЭАЭ, тонус хвоста будет ниже, что будет заметно по постепенному опусканию хвоста. В конце концов, мышь вообще не сможет поднять хвост
.
4. Поместите каждую отдельную мышь, участвующую в эксперименте EAE, на чистую скамью и наблюдайте и документируйте поведение при ходьбе. В таблице 1 приведены балльные критерии для оценки тяжести заболевания (оценка EAE).
5. Оцените и задокументируйте вес каждой мыши, участвующей в эксперименте.
6. Чтобы обеспечить достаточное потребление пищи и воды мышами с клиническим баллом ЭАЭ 1, положите увлажненную пищу в пластиковую миску на дно клетки и ежедневно обновляйте.

Results

Рисунок 1: Графическое представление мест инъекции для индукции EAE. 1) Место инъекции 30 мкл MOG-эмульсии в правый фланг, 2) место инъекции 30 мкл MOG-эмульсии в левый бок, 3) место инъекции 20 мкл MOG-эмульсии в левый хвостовой корень, 4) место инъекции 30 мкл MOG-эмульсии в правый хвостовой корень, 5) место введения небольшого количества капли MOG-эмульсии в область горлышка.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Разведение пищи	Например, PROVIMI KLIBA SA	No 3336
Индивидуально вентилируемые клетки, синяя линия типа II или III	Например, Tecniplast	1145Т, 1285Л
Самки мышей C57BL/6J (8-12 недель)	Например, Janvier Labs		Суки, 8-12 недель
Игла для инъекций 18G x 11/2'' (1,2 мм x 40 мм)	Например, BD, BD Microlance 3	304622
27G x 3/4'' – Nr. 20 (0,4 мм x 19 мм) игла для инъекций	Например, BD, BD Microlance 3	No 302200
Игла для инъекций 30G x 1/2'' (0,3 мм x 13 мм)	Например, BD, BD Microlance 3	304000 (Английский
Неполный адъювант Фрейнда (ИФА)	Например, Санта Круз Биотехнологии	СК-24648	Хранить при температуре 4°C
Поддерживающее питание	Например, PROVIMI KLIBA SA	No 3436
Пептид MOGaa35-55	например, GenScript		Хранить при температуре -80 °C
Микобактерия туберкулеза H37RA	Например, BD	231141	Хранить при температуре 4 °C
NaCl 0,9 %	Б. Браун	3535789
Omnican 50 30G x 1/2''	Б. Браун	9151125С
Коклюшный токсин	Например, List biological laboratories, Inc.	180	Хранить при температуре 4 °C
Ножницы для стежков	Ф.С.Т	15012-12
шприц 1 мл	Например, PRIMO	62.1002 Корпус 62.1002
шприц 10 мл	Например, CODAN Medical ApS	2022-05