$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Анализ проницаемости in vivo
- Препараты растворов:
- Для стоковых растворов декстрана растворите 10 мг 10 кДа Dextran Alexa Fluor 488, а также 3 кДа Dextran Texas Red в 500 мкл 0,9% раствора натрия хлорида (20 мг/мл).
- Для рабочего раствора декстрана непосредственно перед инъекцией нанесите 55 мкл стокового раствора декстрана Alexa Fluor 488 10 кДа (20 мг/мл) на кусок герметизирующей пленки и добавьте 55 мкл стокового раствора декстрана Texas Red 3 кДа (20 мг/мл). Смешайте и наберите 100 μL в одноразовый шприц тонкой очистки (конечная концентрация 2 мг/100 μл).
- Для получения 10% раствора формальдегида (параформальдегида, или PFA) смешайте 10 г сверхчистого порошка PFA, 100 мл PBS и 200 мкл 1N гидроксида натрия (NaOH) в чистом стеклянном стакане и нагрейте ровно до 56 °C при перемешивании с помощью магнитной мешалки. Держите при температуре 56 °C в течение 30 минут, пока PFA полностью не растворится. Охладите до комнатной температуры, отрегулируйте pH до 7,4 и отфильтруйте через бумажный фильтр. Хранить при температуре —20 °C. Исходный раствор можно дополнительно разбавить с помощью фосфатного буферного раствора или PBS.
- Кратковременно обезболите здоровых мышей C57BL/6 или мышей C57BL/6, страдающих экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом или EAE с помощью изофлурана (мышь будет находиться под действием седативных препаратов в течение примерно 1 минуты). Используйте автоматизированную систему (мыши будут подвергаться воздействию 4,5% изофлурана в кислороде в индукционной камере, а затем переводятся в маску для лица с 2,1% изофлураном).
- Поместите мышь под наркозом в боковое положение на столе, затем внутривенно (например, ретроорбитально) введите 100 мкл флуоресцентных индикаторов в мышь до того, как мышь проснется.
- Немедленно снимите маску для лица и убедитесь, что мышь полностью проснулась и подвижна после короткой анестезии. Дайте индикатору циркулировать в течение 15 минут.