Иммуноокрашивание черепно-лицевых тканей мышей

Аннотация

Источник: Yang, J., et al., Подготовка тканей и иммуноокрашивание черепно-лицевых тканей мышей и недекальцинированных костей. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует иммунофлуоресцентное окрашивание криоразделов из эмбриональных черепно-лицевых тканей мышей с использованием флуоресцентной микроскопии для оценки экспрессии ядерных маркеров и определения клеточной пролиферации и сигнальной активности.

Протокол

Текст отказа от ответственности: Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этике животных.

1. Иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Вынимайте предметные стекла при температуре до -80 °C. Держите предметные стекла при температуре RT в течение 1 часа, чтобы просушить срезы на воздухе. Промойте предметные стекла в 0,1% PBST (0,1% трет-октилфениловый эфир полиэтиленгликоля в PBS; см. Таблицу материалов) три раза в течение 5 мин для промывания ОКТ и пермеабилизации срезов.
2. По желанию выполните забор антигена (по желанию).
   1. Разогрейте цитратный буфер (10 мМ цитрата натрия pH 6) в чашке для окрашивания с помощью пароварки или водяной бани до 95–100 °C. Погрузите предметные стекла в цитратный буфер и выдерживайте в течение 10 минут.
   2. Достаньте форму для окрашивания из пароварки или водяной бани и охладите предметные стекла при комнатной температуре в течение 20 минут или дольше15.
      заметка: В качестве альтернативы используйте буфер Tris-EDTA (10 мМ трис-основание, 1 мМ ЭДТА, 0,05% твин 20, рН 9,0) или буфер ЭДТА (1 мМ ЭДТА, 0,05% твин 20, рН 8,0) для извлечения антигена, вызванного теплом. Используйте скороварку, микроволновую печь или водяную баню для извлечения антигена, вызванного теплом, в дополнение к горячей пароварке. Еще одной альтернативой является индуцированное ферментами извлечение антигена с помощью трипсина или пепсина. Оптимизируйте концентрацию и время обработки ферментативного извлечения, чтобы избежать повреждения срезов. Оптимизируйте метод извлечения антигена для каждой комбинации антитело/антиген.
3. Инкубируйте каждое предметное стекло с 200 μл раствора для блокировки (5% сыворотка осла, разведенная в 0,1% PBST) на RT в течение 30 минут, затем удалите раствор для блокировки без промывки.
4. Инкубируйте каждое предметное стекло со 100 мкл первичного антитела или антител, разведенных в блокирующем растворе, в течение 1 ч при ОТ или О/Н при 4 °С. Промойте предметные стекла PBS три раза в течение 10 мин каждый при ЛТ.
5. Инкубируйте каждое предметное стекло со 100 μл вторичного антитела, разведенного в блокирующем растворе, в течение 1 ч при ЛТ. Промойте предметные стекла в PBS три раза по 10 мин каждый при ЛТ. Защитите предметные стекла от света.
6. Крепление слайдов.
   1. Добавьте две капли средства против выцветания с DAPI (4', 6-диамидино-2-фенилиндол) на предметное стекло. Затем накрываем покровной крышкой.
   2. Хранить при температуре 4 °C в темноте до готовности к нанесению изображений.
      заметка: В качестве альтернативы пометьте ядра красителем DAPI или Hoechst 33324, разведенным в соотношении 1:2000 в PBS при RT, а затем добавьте глицерин.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Alexa fluor 488-goat вторичное антитело против кролика	Инвитроген	А-11034
Крепление Antifade с DAPI	Инвитроген	П36931
Бычий сывороточный альбумин	сигма	А2153
Покровные стекла	Бренд Фишер	12-545-Е
криостат	Лейка	КМ1850
Эдта	сигма	Е6758
Флуоресцентный микроскоп	Олимп	БХ51
Предметные стекла для микроскопа	Бренд Фишер	Телефонный номер 12-550-15
Компаунд ОКТ	Фишер Хэлскес	Тел.: 23-730-571
Параформальдегид (PFA)	сигма	П6148
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	сигма	П4417
Полиэтиленгликоль трет-октилфениловый эфир	сигма	Т9284	Тритон Х-100
Антитела кролика к Ki67	Технология клеточной сигнализации	9129	Лот#:3; РРИД:AB_2687446
Антитело кролика к pSmad1/5/9	Технология клеточной сигнализации	13820	Лот#:3; РРИД:AB_2493181
Цитрат натрия	сигма	1613859
Трис	сигма	10708976001