Визуализация везикул в нейронах с помощью флуоресцентной визуализации

Abstract

Источник: Цурута, Ф., и др. Количественная оценка эндосомных и лизосомных модиальностей в культивируемых нейронах с использованием флуоресцентных зондов. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео демонстрирует, как нейронные везикулы помечаются специфическими флуоресцентными белками для визуализации их движения. Сначала плазмиду, кодирующую флуоресцентный белок, инкубируют с трансфективным агентом, а затем вводят в культуру нейронов. Впоследствии изображения нейронов получают и анализируют, чтобы отследить движение везикул.

Protocol

1. Визуализация моторики везикул

1. Подготовьте плазмиды, которыми будет маркироваться каждый тип пузырьков. Например, используйте EGFP-Rab5 для ранних эндосом, EGFP-Rab7 для поздних эндосом, LAMP-EGFP для лизосом и EGFP-LC3 для аутофагосом><. заметка: Эти плазмиды можно получить по запросу в tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. Как правило, через 3-5 дней in vitro (деление или DIV) нейроны могут быть трансфицированы этими плазмидами с использованием трансфекционных реагентов.
2. Смешайте 4,0 мкг плазмид с 200 мкл бессывороточной среды путем пипетирования. В отдельной пробирке разведите 8 мкл реагента для трансфекции (см. Таблицу материалов) в 200 мкл среды, не содержащей сыворотки. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
3. Смешайте раствор плазмиды и раствор трансфекции Регент на шаге 1.2 с помощью пипетирования. Инкубировать в течение 20 минут при RT.
4. Добавьте бессывороточную среду и 400 мкл плазмидного раствора с шага 1.3 в каждую покрытую стеклянным дном чашку, содержащую корковые нейроны головного мозга, корковую культуральную среду. Инкубируйте нейроны при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 в течение 30 минут. Замените среду 2 мл питательной среды для коры головного мозга. Инкубируйте нейроны при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 в течение 1-2 дней.
   заметка: Приготовьте питательную среду коры головного мозга, состоящую из базальной среды нейронов с добавлением 1x добавок B-27, 2 мМ L-глутамина и 100 ЕД/мл пенициллин-стрептомицина.
5. Через 1 - 2 дня после трансфекции выберите трансфицированные клетки для получения изображения.
   заметка: Недоношенные нейроны менее 7 DIV имеют тенденцию проявлять динамическую подвижность везикул. Выбирайте нейроны, которые умеренно экспрессируют флуоресцентный зонд, потому что при выборе нейрона с высокой экспрессией невозможно получить четкие изображения. Кроме того, выберите типичную форму нейронов, такую как пирамидальные нейроны, которые имеют длинные аксоны и сложные дендриты, для облегчения идентификации аксона и дендритов (см. рисунок 1A).
6. Получение изображений с помощью системы цейтраферной съемки: Для получения изображений используйте флуоресцентный микроскоп, оснащенный камерой с устройством с зарядовой связью (ПЗС) с объективами 40X Plan Apo 0.95NA или 100X Plan Apo VC NA1.4. Контролируйте температуру на уровне 37 °C с помощью инкубационной системы. Получение изображений нейронов в течение одного кадра/5 с в течение 100 секунд под контролем программного обеспечения для получения изображений. В качестве альтернативы можно получать изображения через более короткие промежутки времени и в течение более длительных периодов времени, например, по одному кадру в 2 с в течение 300 секунд.
   заметка: Существуют различные приложения для получения последовательных изображений, многие из которых подойдут для этого метода. Поэтому не рекомендуется никакого конкретного применения; Вместо этого каждый исследователь должен использовать любое доступное приложение.

2. Анализ изображений

1. Откройте все последовательные изображения в программе ImageJ с помощью функции ручного отслеживания.
   заметка: На сегодняшний день ручное отслеживание широко используется в экспериментах по отслеживанию. Ручное отслеживание было разработано доктором Фабрисом Кордельером. Подробные письменные инструкции доступны в Интернете. Для анализа качество данных визуализации улучшается с помощью достаточного количества изображений. Рекомендуется использовать более 20 изображений.
2. Чтобы объединить последовательные изображения, выберите→ → . Щелчок.
3. Выберите → ; появится всплывающее окно отслеживания.
4. Нажмите на флажок и задайте параметры отслеживания в разделе параметров.
   заметка: Можно задать несколько параметров, включая временной интервал, калибровку x/y, калибровку z, размер квадрата поиска для центрирования, размер точки, ширину линии и размер шрифта. В этом упрощенном анализе были определены как временной интервал, так и x/y калибровка. При других экспериментальных обстоятельствах может потребоваться определение и других параметров. Здесь используются следующие параметры: 5 с, а также 0,26642 мкм для объектива 40X Plan Apo 0,95NA или 0,10657 мкм для объектива 100X Plan Apo VC NA1.4.
5. После того, как параметры определены, нажмите на кнопку, чтобы начать новый трек.
6. После определения интересующих вас везикул (например, везикул, обозначенных синими и красными стрелками на рисунке 1A (правая панель)), щелкните по центру сигналов на последовательных изображениях, чтобы записать координаты xy. Результаты записанных координат, расстояния и скорости xy отображаются в новом окне.
   заметка: В случае лизосом в нейронах часто наблюдаются большие яркие флуоресцентные сигналы (например, рисунок 1А (правая панель), оранжевая стрелка). Эти сигналы иногда проявляют либо накопленные везикулы, либо патологическое варикозное расширение, поэтому этих сигналов следует избегать для количественной оценки моторики.
7. Повторите шаг 2.6 для сбора координат xy везикул из всех последовательных изображений; после выбора точки отсчета каждое изображение автоматически переходит к следующему изображению.
8. Экспортируйте эти данные в новую таблицу (например, таблицу). Используйте соответствующее программное обеспечение для создания подходящего графика (см. Таблицу материалов).
   заметка: Чтобы проанализировать данные, выберите столбец, просуммируйте все значения этого столбца и покажите расстояние подвижности в виде гистограммы, как показано на рисунке 1B. Кроме того, повторите этот шаг, рассчитайте среднее значение общего расстояния моторики и покажите его в виде гистограммы, как показано на рисунке 1C. Программное обеспечение для создания гистограммы и данных осциллограмм показано в Таблице материалов.

Results

Рисунок 1: Подвижность лизосом в дендритах нейронов. (А) Нейроны коры головного мозга мыши (4 DIV) трансфицировали плазмидой LAMP-EGFP в течение 2 дней. На этом изображении показана подвижность LAMP-EGFP-содержащих везикул в дендритах. На врезке показано покадровое изображение LAMP-EGFP-положительных везикул. Красная стрелка указывает на движущийся везикул, а синяя стрелка указывает на покоящийся пуз...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Нейробазальная среда	Термо Фишер	No 21103-049
Opti-MEM	Термо Фишер	31985070	Среда без сыворотки
Пеницилин стрептмицин	Термо Фишер	15140122
L-глютамин	Термо Фишер	25030081
Пищевые добавки B-27	Термо Фишер	17504044
поли-D-лизина гидробромид	сигма	П7280
поли-L-орнитин	сигма	П4957
Липофектамин 2000	Термо Фишер	11668027	Реагент для трансфекции
Полиэтиленимин "Макс"	Полинауки	No 24765	Реагент для трансфекции. В качестве альтернативы липофектамину2000 доступен 0,1 мг/мл полиэтиленимина, растворенного в стерилизованной воде. Но это низкая эффективность и высокая токсичность.
БИОРЕВО BZ-9000	Кейенс	NA
Инкубационная система INUG2-K13	Токайский хит	NA
GraphPad Prism версия 6.0	Программное обеспечение GraphPad	NA
Версия Excel 15	Майкрософт	NA
ImageJ версия 1.47	NA	NA