Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Иммунофлюоресценция
- Приготовьте растворы, включающие блокирующий буфер, буфер антител, промывочный буфер 1 и промывочный буфер 2 (см. таблицу 1).
- Один раз промойте ломтики фосфатным буфером (PB), чтобы удалить избыток соединения оптимальной температуры резания (OCT).
- Удалите раствор с помощью пластиковой пипетки, не засасывая срезы мозга. Добавьте 250 μL свежего PB с помощью пипетки объемом 1000 μL.
осторожность: Ломтики не должны пересыхать, поэтому хорошо выньте и добавьте жидкость.
- Извлеките PB с помощью пластиковой пипетки и добавьте 250 μL блокирующего буфера на лунку с помощью пипетки объемом 1000 μL. Инкубировать в течение 3 ч при комнатной температуре (RT) на шейкере.
- Во время инкубации разведите первичные антитела в буфере антител в реакционной пробирке. Используйте буфер для антител объемом 250 мкл на лунку и добавьте соответствующее количество антитела (см. таблицу 2), пипетируя его непосредственно в раствор с помощью пипетки объемом 2 мкл. Перемешайте раствор, аккуратно пипетируя вверх и вниз несколько раз. Вскоре после этого Vortex для обеспечения правильного смешивания.
заметка: Для определения фоновой флуоресценции окрашивание также следует проводить без добавления первичного антитела. Для этого срез инкубируют в растворе антител без первичных антител в соответствии с протоколом.
- По истечении времени инкубации удалите блокирующий буфер пластиковой пипеткой и добавьте 250 мкл раствора антител, содержащего первичные антитела, на лунку. Инкубируйте ломтики с первичным антителом в течение ночи при 4 °C на шейкере.
- На следующий день промойте ломтики с промывочным буфером 1 3x в течение 10 минут при RT на шейкере.
- Удалите среду с помощью пластиковой пипетки и добавьте 300 мкл промывочного буфера 1 на лунку. Инкубировать при RT в течение 10 минут. Повторите 3 раза.
- На этапах промывки разбавляйте вторичные антитела, связанные с флуорофором, в буфере антител в реакционной пробирке. Используйте буфер для антител объемом 250 мкл на лунку и добавьте соответствующее количество антитела (см. таблицу 2), пипетируя его непосредственно в раствор с помощью пипетки объемом 2 мкл. Перемешайте раствор, аккуратно пипетируя вверх и вниз несколько раз. Вскоре после этого Vortex для обеспечения правильного смешивания.
осторожность: Поскольку антитела чувствительны к свету, все шаги с этого момента необходимо выполнять в темноте.
- После этапов промывки удалите промывочный буфер с помощью пластиковой пипетки и добавьте 250 мкл раствора антител, содержащего вторичные антитела, на лунку. Инкубируйте срезы со вторичными антителами в течение 90 мин при РТ в темноте.
- Промойте ломтики с промывочным буфером 2 3 раза в течение 10 минут при RT.
- На этапах промывки разведите 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в 0,1 М PB в концентрации 1:2000.
- Снимите промывочный буфер 2 с помощью пластиковой пипетки и добавьте 250 мкл раствора DAPI на лунку. Инкубировать в течение 5 минут при RT на шейкере.
- Удалите раствор DAPI с помощью пластиковой пипетки и добавьте 500 мкл 0,1 М PB на лунку с помощью пипетки объемом 1000 мкл.
- Закрепите срезы на предметных стеклах микроскопа.
- Поместите предметное стекло микроскопа под стереоскоп. Тонкой кистью нанесите на предметное стекло три отдельные капли по 0,1 М PB. Поместите по одному срезу на предметное стекло микроскопа.
- Используйте тонкую кисть, чтобы разгладить и сориентировать срезы на предметном стекле микроскопа.
- Когда все ломтики расположены правильно, удалите излишки PB салфеткой и тщательно высушите предметное стекло.
осторожность: Избегайте полного высыхания мозговых срезов.
- Добавьте на предметное стекло 80 μл закладной среды. Аккуратно опустите покровный стекло на предметное стекло, тем самым заделав срезы мозга.
- Оставьте предметные стекла сохнуть в вытяжном шкафу на 1-2 часа (накройте их во избежание воздействия света) и храните в предметной коробке микроскопа при температуре 4 °C.
заметка: Протокол можно поставить на паузу здесь.
2. Визуализация
- После того как закладная среда полностью затвердеет, поместите предметное стекло микроскопа под конфокальный микроскоп.
заметка: Эпифлуоресцентная микроскопия в сочетании с программным обеспечением для деконволюции должна обеспечить аналогичное качество изображения.
- Отрегулируйте настройки лазера, увеличивая или уменьшая интенсивность лазера для каждого канала, чтобы переэкспонировать несколько пикселей для обеспечения максимального распределения значений серого.
- Приобретайте виртуальные ткани всего среза мозга для различных каналов.
- В программном обеспечении для визуализации выберите опцию «Плитки» и вручную очертите срез мозга с помощью параметра «Настройка области мозаики».
- Распределите точки поддержки по всей области плитки и отрегулируйте фокус для различных точек поддержки, нажав кнопку Проверить области/положения плитки....
- Отрегулируйте настройки в режиме сбора данных в соответствии с желаемым разрешением и размером файла полученного изображения и запустите сканирование.
- Когда сканирование будет завершено, используйте функцию сшивания для обработки виртуальной ткани. Экспортируйте файл в виде .tif с помощью функции «Экспорт изображений».
3. Компьютерный анализ
- Загрузите все отдельные каналы для одного изображения в FIJI, нажав Файл| Открыть.
- С помощью инструмента «Произвольное выделение» очертите одно полушарие в канале DAPI. Создайте маску выделения, нажав Edit| Выбор| Создаем маску.
- Определите среднюю интенсивность флуоресценции для отдельных каналов (Mover и synaptophysin), нажав кнопку «Анализировать| Мера.<бр />
заметка: Обязательно выберите различные каналы, чтобы определить средние значения интенсивности флуоресценции для каждого канала.
- Скопируйте среднюю интенсивность флуоресценции для отдельных каналов в таблицу.
- Определите среднюю интенсивность флуоресценции для отдельных каналов в области интереса, очертив область также с помощью инструмента Произвольное выделение. Используйте атлас мозга мыши в качестве эталона.
- Повторите шаги 3.1-3.5 для всех полушарий и всех областей интереса.
заметка: Определите значения для каждого полушария отдельно, чтобы впоследствии сравнить значения в интересующей области с значениями в полушарии (см. шаг 4.2).
4. Обработка данных
- Если фоновая флуоресценция высокая, может потребоваться вычитание фона. Для этого определите среднюю интенсивность флуоресценции для среза, обработанного без первичного антитела против референсного белка (в данном случае: синаптофизина) и вычтите это значение из всех значений, полученных для областей мозга и полушарий.
- Когда будут определены средние интенсивности флуоресценции для отдельных каналов для каждого полушария и каждой области интереса (см. таблицу 3), рассчитайте отношение Mover к синаптофизину, разделив значение Mover на значение синаптофизина (желтый цвет в таблице 3). Проделайте это действие для каждого полушария и каждой области интереса отдельно.
- Разделите отношение, полученное для одной области интереса, на отношение, полученное для соответствующего полушария (оранжевый цвет в таблице 3), чтобы определить отношение области интереса к полушарию.
- Чтобы определить относительную численность движителя, переведите полученное в 4,2 отношение в проценты, определив его отклонение от 1 (красный цвет в таблице 3). Таким образом, отношение 1,25 дало бы относительную численность Движителя на 25% выше среднего, а отношение 0,75 дало бы относительную численность Движителя на 25% ниже среднего.
Таблица 1: Решения, используемые в этом протоколе.
| Фиксатор (500 мл) |
Смешайте 20г параформальдегида (общее значение: 4%)
50 мл 10x PBS стоковый раствор (всего конц.: 1x)<чел./>
450 мл bidest H2OАdjust pH до 7,4 с NaOH
Примечание: Чтобы растворить параформальдегид в PBS, нагрейте раствор. Не нагревайте выше 70 °C, так как PFA распадается при температурах выше 70 °C.
Внимание: ПФА токсичен, потенциально канцерогенен и тератогенен. При работе с ПФА надевайте перчатки и работайте под вытяжным шкафом. Избегайте приема внутрь. |
| 0.1M PB (1L) |
Стоковое решение X
35,61 г Na2HPO4,2H 2O in 1 L bidest H2O | Стоковое решение Y
27,60 г2PO 4,2H 2O in 1 L bidest H2O |
Mix 385 мл стокового раствора X
115 мл стокового раствора Y
500 мл бидест H2O |
| Буфер блокировки (50 мл) |
Смешайте 1,25 мл нормальной козьей сыворотки (общая концентрация: 2,5%)
1,25 мл нормальной ослиной сыворотки (общая концентрация: 2,5%)
0,5 мл неионогенного поверхностно-активного вещества (Triton-X100, общее значение: 1%)
47 мл 0,1 М ПБ |
| Буфер антител (50 мл) |
Смешайте 0,25 мл нормальной козьей сыворотки (общая концентрация: 0,5%)
0,25 мл нормальной ослиной сыворотки (общая концентрация: 0,5%)
0,1 мл неионогенного поверхностно-активного вещества (общее значение: 0,2%)
49,4 мл 0,1 М ПБ |
| Буфер для стирки 1 (50 мл) |
Смешайте 1 мл нормальной сыворотки для коз (общая концентрация: 2 %)
49 мл 0,1 М ПБ |
| Буфер для стирки 2 (50 мл) |
Смешайте 0,5 мл нормальной козьей сыворотки (общее значение: 1 %)
49,5 мл 0,1 М ПБ |
Таблица 2: Антитела, используемые в этом протоколе.
| Первичные антитела |
| Направлено против | Виды хозяев | РРИД | концентрация |
| двигатель | кролик | AB_10804285 | 1:1000 |
| Синаптофизин | морская свинка | AB_1210382 | 1:1000 |
| Вторичные антитела |
| Целевые виды | Виды хозяев | Флуорофор | концентрация |
| кролик | осел | АлексаФлюор 647 | 1:1000 |
| морская свинка | коза | АлексаФлюор 488 | 1:1000 |
Таблица 3: Пример обработки данных.
| Полушарие |
| Полушарие # | Средняя интенсивность флуоресценции синаптофизина (а.е.) | Средняя интенсивность флуоресценции Mover (а.е.) | Соотношение Mover/Synaptophysin | | |
| 1<чел. />
2<чел. />
3<чел. />
4<чел. />
5<чел. />
6 | 29.134<чел. />
31.008<бр />
38.641<чел. />
30.775<бр />
21.658<бр />
27 .277 | 22.810<чел. />
24.046<бр />
29.324<бр />
25.444
18.091<бр />
23.364 | =C3/B3 0,783
=C4/B4 0,775
=C5/B5 0,759
=C6/B6 0,827
=C7/B7 0,835
=C8/B8 0,857 | | |
| Гиппокамп |
| Полушарие # | Средняя интенсивность флуоресценции синаптофизина (а.е.) | Средняя интенсивность флуоресценции Mover (а.е.) | Соотношение Mover/Synaptophysin | Отношение к полусфере | Относительная численность движителя (%) |
| 1<чел. />
2<чел. />
3<чел. />
4<чел. />
5<чел. />
6 | 35.26<чел. />
33.955< чел. />
41.231<бр />
39.853< чел. />
30.129<бр />
Количество: 28.737 | 29.889
27.825<чел. />
31.978<чел. />
31.787<бр />
27.817<чел. />
25.861 | =C11/B11 0,848
=C12/B12 0,819
=C13/B13 0,776
=C14/B14 0,798
=C15/B15 0,923
=C16/B16 0,900 | =D11/D3 1,083
=D12/D4 1,057
=D13/D5 1.022
=D14/D6 0.965
=D15/D7 1.105
=D16/D8 1.051 | =(E11-1)*100 8.269
=(E12-1)*100 5.673
=(E13-1)*100 2.200
=(E14-1)*100 -3.528
=(E15-1)*100 10.530
=(Е16-1)*100 5.064 |
