Оценка структурной целостности нервно-мышечных соединений дорсальных продольных мышц у дрозофил

Аннотация

Источник: Sidisky, J. M., et al. Визуализация синаптической дегенерации у взрослых дрозофил в связи с нейродегенерацией. J. Vis. Exp. (2020).

Это видео демонстрирует протокол оценки структурной целостности нервно-мышечных соединений в дорсальных продольных мышцах дрозофилы. Процедура включает в себя окрашивание нейронов и мышц двумя различными антителами и сравнение флуоресцентных паттернов у мутантных и диких мух. Снижение окрашивания нейронов у мутантных мух указывает на нейродегенерацию, при этом мышечная структура остается неповрежденной.

Протокол

1. Мгновенная заморозка и бисекция грудной клетки

1. Перед началом бисекции наполните колбу Дьюара жидким азотом, надев соответствующие криозащитные перчатки и защитные очки. Приобретите измельчитель лезвий, перьевые лезвия, одну пару тонких щипцов, лед, ледяной 1x PBS и криогенный пинцет.
2. Приготовьте ведро со льдом, чтобы 1x PBS лед оставался холодным.
3. Используйте отбойник, чтобы захватить перьевое лезвие под углом и согнуть лезвие, чтобы отломить небольшой кусочек. Затем отбойный молоток может зафиксировать лезвие в нужном положении для использования в качестве небольшого скальпеля.
   заметка: Одного лезвия должно хватить на все группы. Переключитесь, если лезвие сломалось или затупилось.
4. Добавьте чистый наконечник для дозатора в P200 и удалите 1/5 часть наконечника для транспортировки образцов.
5. Подготовьте новую микроцентрифужную пробирку для каждой группы и добавьте 200 мкл 1x PBS в каждую пробирку. Эта вторая трубка будет использоваться для сбора окончательных препрепов DLM.
6. Удалите все 1x PBS из пробирок с помощью пипетки Пастера.
7. Надев соответствующие средства защиты, погрузите пробирку в колбу с жидким азотом на 10 с помощью криогенного пинцета.
   заметка: Трубки должны быть плотно закрыты, чтобы трубка не взорвалась.
8. Извлеките пробирку из жидкого азота и добавьте примерно 300 мкл ледяного 1x PBS в образцы с помощью пипетки Пастера. Храните образцы на льду.
9. Добавьте ледяной 1x PBS в 10-сантиметровую диссекционную чашку, покрытую силиконовым эластомером, и выведите первую грудную клетку модифицированной пипеткой объемом 200 μл.
10. Поместите грудную клетку вентральной стороной вверх. В одной руке используйте тупую пару щипцов, чтобы расположить грудную клетку, а в другой используйте тонкую пару щипцов, чтобы удалить часть грудного ганглия, чтобы обнажить среднюю линию грудной клетки.
11. Используйте среднюю линию грудной клетки в качестве ориентира, чтобы сделать неглубокий надрез лезвием на 1/3 части грудной клетки.
12. Извлеките лезвие из грудной клетки и расположите грудную клетку под углом 45° с помощью тупых щипцов. Вставьте лезвие обратно и разрежьте прямо по средней линии грудной клетки. В результате получится два гемитора.
13. Возьмите по одному гемитораксу за раз и удалите избыток ткани под мышечным волокном F DLM (Рисунок 1B), самым вентральным волокном. С помощью лезвия осторожно сделайте один или два надреза, чтобы удалить лишнюю ткань, не повредив DLM.
14. После изоляции перенесите гемиторакс в нужную трубку с помощью 1x PBS.
15. Повторяйте шаги 1.6\u20121.14 до тех пор, пока не будет получено 10 рассеченных гемиторасов в группе.

2. Структурное окрашивание

1. После разрезания образцов грудной клетки пополам поместите ткань в блокирующий буфер (1x PBS с 0,1% обычной козьей сыворотки и 0,2% Triton X-100 с pH 7,4) для проникновения в ткань и предотвращения неспецифического окрашивания. С помощью пастеровской пипетки удалите избыток 1x PBS и добавьте 1,5 мл блокирующего буфера в каждую пробирку. Блокируйте ткани не менее чем на 1 ч при 4 °C.
2. Подготавливают образцы к структурному окрашиванию с использованием флуоресцентно конъюгированного антитела, пероксидазы хрена 488 (анти-HRP-488) в разведении 1:200 и фаллоидина-647 в разведении 1:1000 в блокирующем буфере для окрашивания мотонейронов и мышечной ткани соответственно. Сделайте достаточное количество морилки, чтобы на тюбик было 150 μл. Храните пятно при температуре 4 °C, накрыв фольгой или в темной коробке, до готовности к окрашиванию.
3. После блокировки удалите излишки блокирующего буфера с помощью стеклянной пастеровской пипетки.
4. Перед нанесением структурного пятна нанесите на него вихревое покрытие. Добавьте по 150 мкл морилки в каждую тюбик. Поместите образцы в темный ящик на вращателе при комнатной температуре на 2 часа.
5. Удалите пятно и постирайте салфетки четыре раза в 1,5 мл комнатной температуры 1x PBS с 0,3% Triton X-100 в течение 5 минут на ротаторе в темной коробке. Теперь образцы готовы к установке на предметное стекло.

3. Монтажная ткань

1. После промывки образцов в ПБСТ подготовьте предметное стекло микроскопа для крепления ткани к окрашиванию. Подготовьте дополнительные принадлежности, включая защитные стекла, пипетку P200, наконечники для пипеток объемом 200 мкл, ножницы, прозрачные армирующие материалы, щипцы с прямыми краями, флуоресцентный монтажный материал, защищающий от выцветания, лак для ногтей и темную коробку для покрытия предметных стекол.
2. Пометьте предметное стекло, чтобы идентифицировать образцы, и очистите его салфетками Кима, чтобы удалить любые пятна.
3. Чтобы покровное скольжение не повредило образцы гемиторакса, соорудите «мост» с помощью армирующих этикеток. Разрежьте одну усиливающую этикетку пополам и разместите каждую половину примерно на расстоянии 15 мм друг от друга. Это расстояние должно быть меньше ширины покровного стекла. Повторите этот шаг четыре раза, чтобы получить «мост» высотой 5 меток.
4. Возьмите пипетку P200 и измените наконечник, отрезав 1/5 часть наконечника, чтобы перенести образцы на предметное стекло. Образцы должны быть перенесены на предметное стекло в центре моста.
5. Возьмите край лабораторной салфетки и удалите излишки PBST. С помощью щипцов расположите DLM таким образом, чтобы все образцы были обращены мышечной стороной вверх, а кутикула — вниз.
6. С помощью стандартного наконечника для дозатора P200 нанесите на предметное стекло 70 μл монтажного материала, избегая образования пузырьков воздуха. Распределите среду по кругу внутри арматуры, начиная с внешней стороны к центру.
7. Наденьте на арматуру защитный лист.
8. С помощью лака для ногтей покройте внешние края по периметру покровного стекла. Нанесите обильно для формирования полного уплотнения ткани.
9. Поместите предметное стекло на плоскую поверхность в темноте, дав ему высохнуть не менее 10 минут и предотвратить фотообесцвечивание или потерю флуоресценции. Теперь слайды можно использовать для получения изображений сразу или хранить в папке слайдов при температуре -20 °C для последующего просмотра.

Результаты

Рисунок 1: Прогрессирующая денервация синапсов DLM в модели БАС у дрозофилы. (A) На схеме показано создание трансгенных мух ALS, экспрессирующих человеческую мутантную форму дегтяр-связывающего белка 43 кДа (TDP-43). (B) На иллюстрации изображена форма и ориентация гемиторакса у взрослой дрозофилы. Используя протокол, мы можем наблюдать прогрессирую...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
32% Формальдегид	Науки электронной микроскопии	No 15714	Сохранение тканей
BenchRocker	Дженеси Сайентиал	31-302	Вращение образцов во время окрашивания
Отбойный молоток	Инструменты для точной науки	10053-09	Используется для удержания перьевого лезвия
Чехлы для крышек	Научный центр Фишера	12548А	Для монтажной ткани
Криогенные перчатки	ВВР	97008-198	Защищайте руки от жидкого азота
Криогенный пинцет	ВВР	82027-432	Держите пробирку объемом 2,0 мл в жидком азоте
колба дьюара-1900 мл	Томас Сайенти	5028М54	Хранение жидкого азота
Перьевые лезвия	Науки электронной микроскопии	72002-01	Лезвия скальпеля
Мелкие передние конечности x 2	Инструменты для точной науки	11252-20	Одна прекрасная пара для очистки средней линии грудной клетки. Другую пару можно притупить с помощью точильного камня.
FITC-конъюгированный анти HRP	Лаборатории Джексона	Тел.: 123-545-021	Окрашивает двигательные нейроны. Используется при концентрации 1:100
морозильная камера (черная)	Научный центр Фишера	14100Ф	Защищает образцы от света
Стеклянные пастеровские пипетки	ВВР	14637-010	Используется для переноса образцов
Стеклянные горки	Научный центр Фишера	12550143	Для монтажной ткани
Монтажный носитель (VECTASHIELD) с защитой от выцветания	ВВР	101098-042 (Английский)	Монтажный носитель сохраняет флуоресцентную сигнализацию
лак	Науки электронной микроскопии	72180	Пломбы для предметных стекол микроскопа
Нормальная козья сыворотка	Научный центр Фишера	PCN5000	Предотвращает неспецифическое связывание антител
малярная кисть	Дженеси Сайентиал	59-204	Перенос мух
ПБС	Научный центр Фишера	10-010-023 (Английский	Солевой раствор для препарирования и окрашивания
Фаллоидин 647	Абкам	AB176759	Окрашивает F-актин в мышечную ткань. Используется в концентрации 1:1000
пластиковая чашка Петри (100 мм)	ВВР	25373-100	Диссекционная чашка
Метки армирования	У.Б. Мейсон	AVE05722	Обеспечивает поддержку стеклянного покровного стекла над установленной салфеткой
Заточный блок	Грейнджер	1РДФ5	Сохранение тонких щипцов острыми, а также затупление отдельной пары
папка для слайдов	ВВР	10126-326	Хранение образцов
Стандартные офисные ножницы	У.Б. Мейсон	ACM40618	Резка армирующих этикеток
Сильгард 184	Науки электронной микроскопии	No 24236-10	Покрытие для анатомической чашки
Тритон-Х-100	Науки электронной микроскопии	No 22140	Способствует проникновению в ткани
Ваннас Диссекционные Сиссоры	Инструменты для точной науки	1500-00	Уед для удаления муховых лапок и выполнения разреза на грудной клетке