Исследование черепно-мозговой травмы личинки данио-рерио с помощью крупномасштабной сканирующей просвечивающей электронной микроскопии

Аннотация

Источник: Kuipers, J. et al., Крупномасштабная сканирующая просвечивающая электронная микроскопия (нанотомия) здорового и поврежденного мозга данио-рерио.J. Vis. Exp. (2016).

Это видео демонстрирует метод исследования черепно-мозговой травмы личинки данио-рерио с использованием крупномасштабной сканирующей просвечивающей электронной микроскопии (STEM), метода, который сочетает в себе элементы как сканирующей электронной микроскопии (SEM), так и просвечивающей электронной микроскопии (TEM) для получения изображений с высоким разрешением. В нем описываются шаги, связанные с подготовкой образцов и получением изображений STEM с высоким разрешением для выявления черепно-мозговой травмы.

Протокол

1. Подготовка образцов

1. Фиксация и встраивание
   1. фиксация
      1. Обезболите личинок рыб трикаином (0,003%), добавленным в воду рыбок данио-рерио (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl₂, 0,33 мМ MgSO_4, 10 мМ HEPES, pH 7,6) и проверьте глубину анестезии, осторожно протыкая наконечником пипетки объемом 200 мкл под микроскопом для вскрытия до тех пор, пока движение не перестанет обнаруживаться (рис. 1A).
      2. При обработке образцов для корреляционной электронной микроскопии (ЭМ) после получения данных визуализации in vivo с использованием конфокальной или двухфотонной визуализации в 1,8% агарозе, как описано, фиксируют личинки в агарозе с использованием 4% параформальдегида (PFA) в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем Triton-X-100 (0,05%).
      3. Вырезают личинок из агарозы и обрабатывают для крупномасштабных ЭМ.
      4. Закрепить личинки в свежем 4% параформальдегиде в PBS, содержащем Triton-X-100 (0,05%), в течение 2 ч при комнатной температуре в пластиковых пробирках.
         заметка: Клетки, выращенные в культуре (in vitro), могут быть непосредственно зафиксированы в глутаральдегиде, как описано на следующем шаге (1.1.1.5).
      5. Удалите раствор и добавьте 100 мкл 0,5% PFA, 2% глутаральдегида (GA) и 0,1 М какодилата натрия (pH 7,4). Хранить в течение ночи при температуре 4 °C. Дважды промыть образцы в 0,1 М какодилате натрия.
      6. Разрежьте головки личинок рострально к заднему мозгу, чтобы облегчить проникновение осмия. Используйте тонкие шприцы/щипцы.
      7. Постфиксированные личинки в 1% тетраоксиде осмия (OsO₄)/1,5% ферроцианиде калия (K₄[Fe(CN)₆]) в 0,1 М какодилат натрия на льду в течение 2 часов и промывают 3 x 5 мин в условиях двойной дистилляции H₂O.
      8. Обезвоживание в этаноле к 20 мин инкубации при повышении концентрации этанола (50%, 70%, 3 раза по 100%).
   2. внедрение
      1. Приготовьте эпоксидную смолу в соответствии со стандартными рецептами, используемыми в EM labs.
         заметка: Мы используем эпоксидную смолу следующим образом: смешиваем 19,8 г глицидного эфира 100, 9,6 г ангидрида 2-додеценилянтарной кислоты и 11,4 г метилнадного ангидрида с помощью магнитной мешалки. Добавьте 0,5 г DMP-30 (трис-(диметиламинометил)фенол) и снова перемешайте.
      2. Инкубируйте личинки в течение ночи в 50% эпоксидной смоле в этаноле (v/v) во время вращения (RT).
      3. Замените разведенную эпоксидную смолу на чистую смолу. Выдерживать 30 минут, снова добавить свежую смолу и инкубировать еще 30 минут. Снова освежите смолу, а затем инкубируйте 3 часа при RT, затем 15 минут при 58 °C и еще 1 час при RT при низком давлении (200 мбар).
      4. Расположите головки в коммерчески доступных силиконовых плоских формах для встраивания под микроскопом для препарирования с помощью иглы или зубочистки так, чтобы передняя часть была обращена к боковой стороне формы или по мере необходимости (рис. 1B).
      5. Полимеризуйте эпоксидную смолу в течение ночи при температуре 58 °C. Если эпоксидная смола все еще слишком мягкая, дайте еще один день полимеризоваться и затвердеть при 58 °C. Проверьте жесткость, надавливая с помощью щипцов. Если при этом легко оставляет углубление, дайте еще один день полимеризоваться и затвердеть при 58 °C. Когда образец полностью затвердеет, приступают к обрезке и разделке.
      6. Удалите излишки смолы с огрызка с помощью бритвенных лезвий (Рисунок 1B).
2. Секционирование, контрастирование и монтаж
   1. секционирование
      1. Разрез блока эпоксидной смолы с помощью ультрамикротома.
      2. Используйте стеклянный нож или алмазный гистонож для резки полутонких срезов (500 нм) для окрашивания толуидиновым синим/основным фуксином (Рисунок 1D), чтобы определить правильное положение.
      3. Переносите полутонкие срезы на микроскопические предметные стекла, захватывая их стеклянной пастеровской пипеткой, кончик которой был закрыт путем плавления в пламени. Сушите на горячей плите, пока не останется воды. Окрашивать в течение 10 сек 1% толуидина синего в воде на горячей плите, а после полоскания водой окрашивать в течение 10 сек 0,05% основного фуксина в 1% тетрабората натрия. Исследуйте с помощью микроскопа с обычным светом от 10X до 40X.
      4. Когда будет достигнуто правильное местоположение/ориентация в мозге, продолжайте разрезать блок эпоксидной смолы алмазным ножом, чтобы разрезать ультратонкие срезы (~ 70 нм; Рисунок 1E)
      5. Используйте легко идентифицируемые анатомические структуры в мозге и вокруг него, включая обонятельные ямки, глаза и границы серого и белого вещества, чтобы определить интересующую область во время ультратонкого среза и отрегулировать угол среза при наклоне образца.
      6. Установите секцию на медные сетки с одним слотом L2 x 1 (Рисунок 1F), чтобы обеспечить непрерывный сбор данных с помощью стержней сетки. Используйте сетки с покрытием Formvar для поддержки секций.
   2. контрастный
      1. Ультратонкие срезы на сетках окрашивают в течение 2 мин в 2% уранилацетат в метанол с последующим нанесением цитрата свинца Рейнольдса еще на 2 мин.

2. Получение изображений

1. Широкомасштабная сканирующая просвечивающая электронная микроскопия (STEM)
   заметка: Мы используем сканирующий ЭМ с внешним сканирующим генератором, способным захватывать несколько больших полей зрения с высоким разрешением с помощью STEM-детектирования. Как правило, одно изображение, сгенерированное таким образом, эквивалентно полям зрения ~ 100 изображений, полученных с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ), что значительно уменьшает количество сшивки.
   1. Монтаж образца в микроскоп
      1. Поместите сетку с секцией в держатель образца с множественной сеткой и перенесите в камеру СЭМ.
   2. Юстировка детектора STEM
      1. Поместите сетку с образцом под луч и переместите его вверх так, чтобы он находился примерно в 5 мм от полюса объектива. Получение изображения на напряжении 20 кВ с помощью внутрилинзового детектора.
      2. Сосредоточьтесь на краю сетки и отрегулируйте рабочее расстояние до 4,0 мм.
      3. Переместите держатель образца в безопасное положение и вставьте детектор STEM.
      4. Центрируйте отверстие детектора STEM в поле изображения, поворачивая регулировочные винты во время съемки с максимальной скоростью с помощью встроенного в объектив детектора.
      5. Осторожно верните держатель для образцов, который будет как раз помещаться между полюсом линзы и детектором.
      6. Получите изображение с помощью встроенного в объектив детектора, чтобы убедиться, что оно находится в области среза.
      7. Переключитесь на детектирование STEM (среда усиления и все квадранты установлены на «минус»), получите изображение и выберите область для сканирования.
      8. Повышаем разгонное напряжение до 21 кВ и ждем стабилизации луча (снова стабильное изображение), затем переходим на 29 кВ с шагом 2 кВ.
   3. Получение изображений
      1. Предварительно облучите образец (чтобы предотвратить изменения яркости, вызванные электронным лучом) путем уменьшения масштаба, чтобы вся сканируемая область помещалась в окно изображения.
      2. Измените апертуру на 120 μм (чтобы сохранить надлежащий динамический диапазон, усиление детектора должно быть уменьшено на один шаг).
      3. Расфокусируйтесь, чтобы изображение стало размытым.
      4. Сделайте сканируемую область как можно более плотной, используя опцию сканирования уменьшенной области.
      5. Установите скорость сканирования таким образом, чтобы кадр сканировался примерно за 1 - 2 сек.<бр/> заметка: В зависимости от размера и ткани это обычно занимает от 1/2 часа (поле зрения 100 x 100 мкм)) до 3 часов (1000 x 500 мкм).
      6. Увеличьте масштаб не менее чем в 100 раз и отсканируйте небольшую область в течение 10 сек.
         заметка: Когда эта область не изменяет свою яркость по сравнению с окружающей средой, достаточно предварительного облучения.
      7. Верните апертуру 30 μм (и усиление STEM на среднем)
      8. Сосредоточьтесь на образце.
      9. Выровняйте диафрагму с помощью воблера (при увеличении ~ 40 000X).
      10. Находясь в фокусе, выберите самую светлую область/объект и установите скорость сканирования таким образом, чтобы были видны детали.
      11. В программном обеспечении микроскопа можно регулировать яркость и контрастность, внимательно наблюдая за гистограммой, чтобы все пиксели находились в динамическом диапазоне. Проделайте то же самое для самой темной области/объектов.
      12. Вернитесь к светлой области и проверьте еще раз. Будьте осторожны, чтобы по обе стороны гистограммы было немного места.
      13. Уменьшите масштаб таким образом, чтобы вся сканируемая область помещалась в окно изображения, и запустите программу сбора больших площадей.
      14. Используйте опцию мастера для настройки мозаики, выбрав область на экране. Используйте размер пикселя 2 - 5 нм в зависимости от того, какие детали необходимы. Используйте время выдержки 3 μс для STEM.
      15. Выберите опцию «автофокус на предыдущей плитке», используйте программное обеспечение для сбора данных с автофокусом по умолчанию с настройками компании по умолчанию, установите флажок «проверить настройку перед выполнением» и определите, куда сохранять данные.
      16. Нажмите «оптимизировать», чтобы проверить настройки микроскопа.
          заметка: Теперь будет показано необходимое время. Это может быть до 72 часов для областей размером 1 x 0,5 мм.
      17. В окне введите «максимальное разрешение плитки» 20 000, чтобы отдельные плитки не были больше 20k x 20k, предотвращая эффект тупых краев. Нажмите «выполнить».
      18. Когда появится запрос на проверку фокусировки и яркости/контрастности (B/C), выключите внешний скан-генератор и тщательно отрегулируйте фокусировку и астигматизм в программном обеспечении микроскопа. Не изменяйте B/C.
          заметка: Рабочую область можно перемещать и изменять увеличение, но увеличение необходимо вернуть к нужному размеру в пикселях.
      19. Снова включите внешний сканирующий генератор и нажмите «Продолжить».

Результаты

Рисунок 1: Рабочий процесс крупномасштабной тканевой электронной микроскопии мозга рыбок данио. (А)7-дневная личинка данио-рерио. (B) Головы личинок данио-рерио, погруженные бок о бок в эпоксидную смолу. (C) Стеклянный нож для полутонкого среза и ориентации образца. (D) Репрезентативный полутонкий окрашенный толуидином в синий цвет, показывающий две...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
химикалии
Низкая температура плавления агарозы	ВВР	444152Г
трикаин	сигма	Е10521
Тритон-Х-100	сигма	Х100
глутаральдегид	Полинауки	1909 г
Какодилат натрия	сигма	С0250
Осмийтетроксид	Науки электронной микроскопии	19114
ферроцианид калия (K4[Fe(CN)]6)	Мерк	No 4984
этанол	ВВР	No 20821.365
уранилацетат	Мерк	8473
тетраборат натрия	Мерк	1063808
Tolduidene blue	Мерк	1273
Основной фуксин	BDH	340324
Цитрат свинца	BDH	Прекращено
ЭПОН
2-додеценилянтарная кислота ангидрид	Серва	No 20755
метилнадный ангидрид	Серва	No 29452
Эфир глицида 100	Серва	No 21045
ДМП-30	Полинауки	553
Стандартная плоская закладная форма	Науки электронной микроскопии	70901
алмазный нож	Диатом Инк.
медные сетки	Науки электронной микроскопии
двусторонняя углеродная лента	Науки электронной микроскопии
Сканер EM Zeiss Supra55	Цейсс
ультрамикротом Leica EM UC7	Лейка
Генератор внешнего сканирования Atlas	Фибики

. г. Кабель г.