Методическая статья

Дифференцировка и созревание эмбриональных стволовых клеток человека в нейральные органоиды

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Cosset, E., et al. Человеческие нервные органоиды для изучения рака мозга и нейродегенеративных заболеваний. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео демонстрируется поэтапный протокол для эмбриональных стволовых клеток человека в нейральные органоиды. Метод включает в себя индуцирование формирования нейронной розетки с последующим контролируемым созреванием и окончательным культивированием на гидрофобной мембране для получения полностью развитых нейронных органоидов.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Поддержание и культивирование недифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs)

  1. Выполняйте поддержание и расширение hSECs в условиях отсутствия питательных веществ путем предварительного покрытия чашек специальным внеклеточным матриксом.
    1. Разморозьте 300 мкл внеклеточного матрикса при 4 °C (типичная концентрация 18-22 мг/мл, держите на льду) и аккуратно смешайте с 15 мл холодной среды DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), чтобы избежать преждевременного гелеобразования внеклеточного матрикса. Добавьте 7,5 мл внеклеточного матрикса в обе колбы T150.
    2. Инкубировать чашки, покрытые внеклеточным матриксом, при температуре 37 °C не менее 1 ч (максимум на ночь).
    3. Удалите среду и семена hESC до плотности 6,5 x 104 клеток/см2.
  2. Поддерживайте H1 (клеточную линию hESC) в среде hESC и 1% пенициллина/стрептомицина.
  3. Пропустите клетки с помощью ферментативной процедуры: добавьте 7,5 мл ферментативного раствора в колбу Т75 см2 в течение 1-2 мин при температуре 37 °С. После полного отделения ячеек добавьте 7,5 мл DMEM-F12 и центрифугируйте в течение 5 минут при 300 x g. Чтобы обеспечить лучшую выживаемость, перекладывайте клетки с желаемой плотностью на чашки, покрытые внеклеточным матриксом, в той же среде, содержащей ингибитор Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK) (10 мкМ) в течение 24 ч.

2. Нейронные органоиды, полученные из hESC

  1. За 24 ч до начала 3D-культивирования замените среду hESC на бессывороточную среду с добавлением ингибитора 10 мкМ ROCK (оба компонента необходимы для поддержания выживания клеток и спонтанного формирования нейросферы во время фазы агрегации в микролуночном планшете). Клетки должны быть на 60% конфлюенции. На следующий день (день 0) отделите колонии hESC как отдельные клетки: удалите среду, промойте PBS без Ca2+/Mg2+, добавьте 5 мл ферментативного растворенного раствора и инкубируйте при 37 °C в течение 1-2 минут.
  2. Соберите клетки в бессывороточную среду с добавлением 10 мкМ ингибитора ROCK и центрифугируйте их при 300 x g в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и подсчитайте клетки в 10 мл бессывороточной среды с добавлением 10 мкМ ингибитора ROCK.
  3. Параллельно промойте микролуночный планшет 2 мл бессывороточной среды на лунку и центрифугируйте планшет при 1200 x g в течение 5 минут, чтобы удалить все пузырьки, которые могут предотвратить образование нейросферы.
  4. Приготовьте 28,2 х 106 клеток в 12,5 мл бессывороточной среды с добавлением 10 мкМ ингибитора ROCK. Дозирование 1000 ячеек/микролунка. Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 5 минут и поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C на ночь (максимум 36 часов). Например, чтобы получить 30 человеческих нервных органоидов, используйте одну колбу Т150 при 70%-80% слияния (около 30 миллионов клеток).
  5. На следующий день (день 1) соберите шарики (с помощью P1000) и поместите их в тарелку на 6 лунок. В каждую лунку добавьте по 2 мл среды B27 и среды DMEM-F12 GlutaMAX и Neurobasal (смешайте в соотношении 1:1), дополненных 1% добавок B27 и 1% заменимых аминокислот (NEAA). Чтобы способствовать быстрой нервной индукции, дополните среду коктейлем для ингибирования двойного SMAD (Sma и Mad Related Protein), состоящим из 10 μM ингибитора TGFβ (Transforming Growth Factor-beta)/активина/узла и 0,5 μM ингибитора костного морфогенного белка (BMP). Начиная с этого шага вперед, сферы культивируются во вращательном режиме (60 об/мин, орбитальный встряхиватель). Вращение имеет решающее значение для предотвращения слипания сфер или прилипания к пластине.
  6. Меняйте среду каждые 2-3 дня: согните пластину и дайте шарикам упасть в течение 5 минут, удалите половину среды (2 мл) и добавьте 2 мл свежей среды B27 с добавлением факторов роста и ингибиторов. Не центрифугируйте сферы.
  7. Проводите нейронную индукцию в соответствии со следующим временным ходом:
    1. С 1-4 дня культивирование сфер в среде В27 дополняют двойным SMAD. Коктейль двойного ингибирования SMAD (10 мкМ TGFβ/активин/узловой ингибитор и 0,5 мкМ ингибитор BMP) способствует нейронной индукции.
    2. С 4-го по 11-й день стимулируйте пролиферацию нейронных розеток, полученных из hESC (в сферы), добавляя 10 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF) и 10 нг/мл основного фактора фибробластов (bFGF) в среду B27 с добавлением двойного коктейля SMAD.
      заметка: На 11-й день большинство клеток должны быть положительными на Нестин.
    3. С 11-13 дня культивировали сферы в среде В27 с добавлением 0,5 мкМ ингибитора BMP.
    4. С 13-21 дня в среду В27 культивировали с добавлением 10 нг/мл глиального нейротрофического фактора (GDNF), 10 нг/мл нейротрофического фактора мозга (BDNF) и 1 мкМ ингибитора γ-секретазы. GDNF и BDNF способствуют нейрональной и глиальной дифференцировке. Ингибитор γ-секретазы способствует большему созреванию нейронов.
    5. На 21-й день нанесите шары (около 1000 сфер) на гидрофильную мембрану из политетрафторэтилена (ПТФЭ) (диаметр 6 мм, 0,4 мкм), нанесенную на вставку-культуральную пластину, рассчитанную на 6 луночных планшетов. Остановите любое вращение на этом шаге. Наличие розеток, наблюдаемых с помощью светлопольного микроскопа, указывает на инициацию нейронной дифференцировки. Нейронные розетки можно наблюдать через 2-3 дня после нанесения сфер на мембрану из ПТФЭ.
    6. Добавляйте по 1 мл среды B27 с добавлением факторов роста и ингибиторов (как следует) в каждую лунку под мембранным вкладышем каждые 2-3 дня (обычно в понедельник, среду и пятницу) в течение следующих 3 недель дифференцировки.
    7. С 21 по 25 день культивируйте человеческие нервные органоиды в той же среде созревания нейронов.
    8. С 25-28 дня комплементарную среду В27 только с 1 мкМ ингибитором γ-секретазы.
    9. С 28-го по 39-й день прекратите добавление ингибитора γ-секретазы и продолжайте культивирование нервных органоидов человека только в среде B27><. заметка: Через 3 недели нервные органоиды готовы к использованию для имплантации GIC. По мере созревания нейронов наблюдалось снижение незрелого нейрального маркера Нестина и увеличение зрелых нейронных маркеров β3-тубулина и GFAP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
6-луночный планшет (6-луночный планшет)Сокол / КорнингТел.: 07-201-588
Aggrewell 400 (планшеты для микролунок)Технологии стволовых клетокNo 34421 (Английский
Пищевые добавки B27 (B27)Лайф Технологии / Инвитроген1238Для обоих протоколов стоковый раствор 100x, конечный раствор 1x
Нейротрофический фактор головного мозга (BDNF)Управление по ячейкамГФН1-2Для обоих протоколов исходный раствор 100 мкг/мл в чистом H2O, конечный раствор 20 нг/мл
Соединение Е — ингибитор γ-секретазы (ингибитор γ-секретазы)КальбиохимКАС 209986-17-4Для обоих протоколов (ингибитор гамма-секретазы XXI), стоковый раствор 5 мМ в ДМСО, конечный раствор 1 мкМ
Диметилсульфоксид чистый (ДМСО)Сигма-ОлдричС6164Компаунды растворители, готовые к применению
Модифицированная среда Dulbecco Eagle (DMEM)Технологии Life12491-015Для культивирования клеток, готовый к применению
Модифицированная средняя смесь Eagle F-12 от Dulbecco (DMEM-F12)Gibco11320033Для культивирования клеток, готовый к применению
ЭДТА 0,1 мМ (ЭДТА)Технологии LifeАМ9912Для культивирования клеток, готовый к применению
Нейротрофический фактор, полученный из глиальных клеток (GDNF)Управление по ячейкамГФН2-2Для обоих протоколов исходный раствор 100 мкг/мл в чистом H2O, конечный раствор 20 нг/мл
Гидрофильная политетрафторэтиленовая мембрана (мембрана из ПТФЭ)Интерфейс BioCellПрекращено
LDN-193189 (ингибитор BMP)Аксон Медхем /Штемген04-0072-02 /1509Dual/Smad, стоковый раствор 5 мМ в ДМСО, конечный раствор 0,5 мкМ
L-глютамин (L-глютамин)Gibco25030081L-глутамин (200 мМ), стоковый раствор 200 мМ, конечный раствор 2 мМ
Матригель (внеклеточный матрикс)BD Biosciences354277Матрица, сертифицированная hESC, стоковый раствор 18-22 мг/мл, конечный раствор 180-220 мкг/мл
Вкладыш для культуральных планшетов Millicell-CM (0,4 мкм) (вкладыш для культуральных планшетов)МногородностьPICM03050
Моноклональное антитело к β-тубулину IIIсигмаТ8660Разведение 1/1000
Орбитальный шейкер MS, MS-NOR-30 (Орбитальный вибростенд)Основные научные наукиМС-СРН-30
Нейробазальный (Нейробазальный)Life Technologies / Gibco21103049Поддержание и созревание популяций эмбриональных нейрональных клеток, готовых к использованию
Заменимые аминокислоты (NEAA)GibcoNo 11140Заменимые аминокислоты 100X, стоковый раствор 100x, конечный раствор 1x
Антитело к Nurr1 (M-196)Санта-КрусСК-5568Разведение 1/100
Nutristem (среда hESC)Биологическая промышленность05-100-1АСреда для стволовых клеток, готовая к использованию
Пеницилин / Streptomycin (Пеницилин / Streptomycin )Life Technologies / Gibco15140122Для клеточной культуры, стоковый раствор 5 мг/мл, конечный раствор 50 мкг/мл
Фосфатно-солевой буфер без Ca2+/Mg2+ (PBS без Ca2+/Mg2+)Технологии Life14190250Для культивирования клеток, готовый к применению
Rho-ассоциированная киназа Y-27632 (ROCK)Абкам БиокемикалсАБ120129-1Ингибитор горных пород, стоковый раствор 50 мМ в ДМСО, конечный раствор 10 мкМ
SB-431542 (TGFβ/активин/узловой ингибитор)восхождениеАск-163Dual-Smad, стоковый раствор 50 мМ в ДМСО, конечный раствор 10 мкМ
StemPro Accutase (ферментативный раствор hESC)GibcoА11105-01Ферментативный раствор hESC, готовый к применению
Колба Т150 (Фляга Т150)сокол08-772-1Ф
Трансформирующие факторы роста бета-3 (TGFβ3)Управление по ячейкамГФХ109-2Для дофаминергического протокола, стоковый раствор 100 мкг/мл в чистом этаноле, конечный раствор 1 нг/мл
Трипсин 0,25% (ферментативный раствор)Технологии Life15050065ферментативный раствор, готовый к применению
X-vivo (среда без сыворотки)ЛонзаБЭ04-743КСредство без сыворотки, готово к вашему использованию
) г.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SMAD

Похожие статьи