Генерация дофаминергических нейрональных органоидов из эмбриональных стволовых клеток человека

Аннотация

Источник: Cosset, E. et al. Человеческие нейронные органоиды для изучения рака мозга и нейродегенеративных заболеваний. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует дифференцировку человеческих эмбриональных стволовых клеток (hESCs) в дофаминергические нейроны, чтобы предоставить модель для изучения болезни Паркинсона. ЭСК культивируют в среде нейронной индукции в микролуночной пластине для формирования трехмерных нейросфер. Затем их культивируют в среде нейронной индукции, чтобы способствовать дифференцировке в дофаминергические нейроны-предшественники. Окончательное созревание нейронов происходит в культуральной вставке в условиях воздушно-жидкостной границы, в результате чего образуются 3D-органоиды, состоящие из зрелых дофаминергических нейронов.

Протокол

1. дофаминергические органоиды, полученные из hESC, для исследований болезни Паркинсона (БП)

1. День 0: Амплифицируйте hESCs в 2D-культуре до 60% конфлюенции (день 0), затем замените среды стволовых клеток, используемые для поддержания плюрипотентных свойств hESCs, на среду, не содержащую сыворотки. Начните нейронную индукцию с добавления в культуральную среду 0,5 мкМ ингибитора костного морфогенетического белка (BMP) и 10 мкМ трансформирующего фактора роста бета (TGFβ)/активина/узлового ингибитора (коктейль двойного ингибирования SMAD), затем добавьте 10 мкМ ингибитора Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK) в течение 24 ч для увеличения выживаемости клеток во время пассажа.
2. День 1: Приготовьте микролуночный планшет с 2,5 мл на лунку бессывороточной среды с добавлением 0,5 мкМ ингибитора BMP, 10 мкМ TGFβ/активина/узлового ингибитора и 10 мкМ ингибитора ROCK. Чтобы определить клетки в направлении вентрального рисунка нервной трубки, добавьте 100 нг/мл звукового ежа (SHH), 100 нг/мл фактора роста фибробластов 8 (FGF8) и 2 мкМ разглаженного агониста. Центрифугируйте планшет (только со средой и без ячеек) при 1200 х г в течение 5 мин для удаления пузырьков воздуха из микролунок.
   1. После 1 дня нейронной индукции в 2D удалите среду и быстро промойте фосфатно-солевым буфером (PBS) без Ca²⁺/MgCl²⁺. Диссоциировать колонии в суспензии одиночных клеток путем добавления 7,5 мл рекомбинантного ферментативного раствора в колбу T75 см². Инкубировать в течение 2 минут при 37 °C, затем добавить 7,5 мл модифицированной смеси Eagle Medium/питательных веществ F-12 (DMEM-F12) от Dulbecco.
   2. Соберите клеточную суспензию и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и подсчитайте клетки в той же среде, которая использовалась для приготовления микролуночного планшета.
   3. Отрегулируйте объем среды, чтобы получить клеточную суспензию, позволяющую формировать нейросферы, содержащие 1000 клеток на микролунку (например, используемая здесь микролуночная пластина содержит 4700 микролунок на лунку). Итак, подготовьте 4,7 млн клеток в 2,5 мл среды и добавьте ее к предыдущим 2,5 мл среды, уже помещенной в пластину.
   4. Чтобы правильно распределить клетки в каждой микролунке, осторожно встряхните планшет и центрифугируйте микролуночный планшет 300 x g в течение 5 мин. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение 24 ч для получения сфер.
3. День 2: Аккуратно промойте микролунки средой и соберите, а затем переложите сферы в обработанную тканью шестилуночную пластину. Замените среду на нейробазальную среду с добавлением 1% B27, 1x заменимых аминокислот (NEAA), 2 мМ L-глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина. Кроме того, добавьте факторы регионализации SHH, FGF8, сглаженный агонист и малые молекулы двойного SMAD-ингибирования.
   1. Поместите сферы во вращение при температуре 37 °C (60 об/мин, орбитальный встряхиватель) и меняйте полу-средние свежедополненные каждые 2-3 дня.
4. День 3: Для усиления нервной индукции и преобразования в нейронных предшественников с идентичностью среднего мозга добавьте в среду ингибитор 3 μM гликогенсинтазы-3 бета (GSK-3β), который активирует путь Wnt/β-катенина. Поддерживать ингибитор GSK-3β в среде до 13-го дня. Разделен на две новые обработанные тканью 6-луночные планшеты для снижения плотности сфер на лунку и предотвращения агрегации сфер.
   заметка: На 8-й день большинство клеток должны быть положительными на Нестин.
5. День 8: Начало созревания нейронов: замените факторы регионализации SHH, FGF8, сглаженный агонист и коктейль двойного ингибирования SMAD на 0,5 мМ дибутирилциклического аденозинмонофосфата (цАМФ) (для содействия созреванию), 20 нМ ингибитора гистондеацетилазы (для выхода из клеточного цикла), 1 мкМ ингибитора γ-секретазы и факторов роста, 10 нг/мл нейротрофического фактора глиальной клеточной линии (GDNF), 10 нг/мл нейротрофического фактора мозга (BDNF), 1 нг/мл трансформирующего фактора роста β3 (TGFβ3) и 5 нг/мл фактора роста фибробластов 20 (FGF20) (оба способствуют выживанию дофаминергических [DA] предшественников). Меняйте средство каждые 2-3 дня.
6. День 21: Создание нейронного органоида: посадка около 100 нейросфер в условиях воздушно-жидкостной границы на политетрафторэтилен (мембрана из ПТФЭ, диаметр 6 мм). Перенесите мембрану во вставку для культуральных планшетов (0,4 мм) и добавьте 1,2 мл среды для созревания нейронов, используемой для дифференцировки нейросферы, как описано ранее.
   1. Остановите любое вращение на этом шаге. Меняйте среду каждые 2-3 дня до тех пор, пока не будет достигнута необходимая временная точка.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
6-луночный планшет (6-луночный планшет)	Сокол / Корнинг	Тел.: 07-201-588
Aggrewell 400 (планшеты для микролунок)	Технологии стволовых клеток	No 34421 (Английский
Пищевые добавки B27 (B27)	Лайф Технологии / Инвитроген	1238	Для обоих протоколов стоковый раствор 100x, конечный раствор 1x
Нейротрофический фактор головного мозга (BDNF)	Управление по ячейкам	ГФН1-2	Для обоих протоколов исходный раствор 100 мкг/мл в чистом H2O, конечный раствор 20 нг/мл
CHIR-99021 (ингибитор GSK-3β)	Аксон Медхим	КТ99021	Для дофаминергического протокола стоковый раствор 7,5 мМ в ДМСО, конечный раствор 3 мкМ
Соединение Е — ингибитор γ-секретазы (ингибитор γ-секретазы)	Кальбиохим	КАС 209986-17-4	Для обоих протоколов (ингибитор гамма-секретазы XXI), стоковый раствор 5 мМ в ДМСО, конечный раствор 1 мкМ
Дибутирил циклик-АМФ (Dibutyryl cAMP)	сигма	Д0627	Для дофаминергического протокола исходный раствор 0,5 М в ДМСО, конечный раствор 0,5 мМ
Модифицированная средняя смесь Eagle F-12 от Dulbecco (DMEM-F12)	Gibco	11320033	Для культивирования клеток, готовый к применению
ЭДТА 0,1 мМ (ЭДТА)	Технологии Life	АМ9912	Для культивирования клеток, готовый к применению
Фактор роста фибробластов 20 (FGF20)	Пепротех	100-41	Для дофаминергического протокола стоковый раствор 100 мкг/мл в чистом H2O, конечный раствор 5 нг/мл
фактор роста фибробластов 8 (FGF8)	Пепротех	ГФХ176-5	Для дофаминергического протокола стоковый раствор 100 мкг/мл в чистом H2O, конечный раствор 100 нг/мл
Нейротрофический фактор, полученный из глиальных клеток (GDNF)	Управление по ячейкам	ГФН2-2	Для обоих протоколов исходный раствор 100 мкг/мл в чистом H2O, конечный раствор 20 нг/мл
Гидрофильная политетрафторэтиленовая мембрана (мембрана из ПТФЭ)	Интерфейс BioCell	Прекращено
LDN-193189 (ингибитор BMP)	Аксон Медхем /Штемген	04-0072-02 /1509	Dual/Smad, стоковый раствор 5 мМ в ДМСО, конечный раствор 0,5 мкМ
L-глютамин (L-глютамин)	Gibco	25030081	L-глутамин (200 мМ), стоковый раствор 200 мМ, конечный раствор 2 мМ
Вкладыш для культуральных планшетов Millicell-CM (0,4 мкм) (вкладыш для культуральных планшетов)	Многородность	PICM03050
Орбитальный шейкер MS, MS-NOR-30 (Орбитальный вибростенд)	Основные научные науки	МС-СРН-30
Добавки N2 (N2)	Инвитроген	17502-048	Для культуры GIC, исходный раствор 100х, конечный раствор 1х
Нейробазальный (Нейробазальный)	Life Technologies / Gibco	21103049	Поддержание и созревание популяций эмбриональных нейрональных клеток, готовых к использованию
Заменимые аминокислоты (NEAA)	Gibco	No 11140	Заменимые аминокислоты 100X, стоковый раствор 100x, конечный раствор 1x
Nutristem (среда hESC)	Биологическая промышленность	05-100-1А	Среда для стволовых клеток, готовая к использованию
Пеницилин / Streptomycin (Пеницилин / Streptomycin )	Life Technologies / Gibco	15140122	Для клеточной культуры, стоковый раствор 5 мг/мл, конечный раствор 50 мкг/мл
Фосфатно-солевой буфер без Ca2+/Mg2+ (PBS без Ca2+/Mg2+)	Технологии Life	14190250	Для культивирования клеток, готовый к применению
Пурморфамин (разглаженный агонист)	Кальбиохим	SML0868	Для дофаминергического протокола, стоковый раствор 10 мМ в ДМСО, конечный раствор 2 мкМ
Rho-ассоциированная киназа Y-27632 (ROCK)	Абкам Биокемикалс	АБ120129-1	Ингибитор горных пород, стоковый раствор 50 мМ в ДМСО, конечный раствор 10 мкМ
SB-431542 (TGFβ/активин/узловой ингибитор)	восхождение	Аск-163	Dual-Smad, стоковый раствор 50 мМ в ДМСО, конечный раствор 10 мкМ
Звуковой еж (SHH)	Управление по ячейкам	ГФХ168-5	Для дофаминергического протокола стоковый раствор 100 мкг/мл в чистом H2O, конечный раствор 100 нг/мл
StemPro Accutase (ферментативный раствор hESC)	Gibco	А11105-01	Ферментативный раствор hESC, готовый к применению
Колба Т150 (Фляга Т150)	сокол	08-772-1Ф
Трансформирующие факторы роста бета-3 (TGFβ3)	Управление по ячейкам	ГФХ109-2	Для дофаминергического протокола, стоковый раствор 100 мкг/мл в чистом этаноле, конечный раствор 1 нг/мл
Трихостатин А (ингибитор гистондеацетилазы)	сигма	Т8552	Для дофаминергического протокола стоковый раствор 100 мкМ в ДМСО, конечный раствор 20 нМ
TrypLE (рекомбинантный ферментативный раствор)	Инвитроген	12604021	Рекомбинантный ферментативный раствор, готовый к применению
Трипсин 0,25% (ферментативный раствор)	Технологии Life	15050065	ферментативный раствор, готовый к применению
X-vivo (среда без сыворотки)	Лонза	БЭ04-743К	Среда без сыворотки, готовая к применению

) г.