Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Артериальная катетеризация
- Обезболивайте мышь с помощью внутрибрюшинной инъекции кетамина и ксилазина, а также обезболивающего средства в соответствии с местной практикой (например, бупренорфина). Щипцы щипцами зажимают задние конечности для подтверждения правильной глубины анестезии.
заметка: Для данного исследования использовались самцы мышей C57BL/6N в возрасте 8−12 недель (масса 20−25 г). Авторы безуспешно тестировали самцов BALB/c того же возраста, но не пробовали другие штаммы.
- Удалите волосы в интересующих областях (голова, шея) с помощью электрической бритвы. Следите за тем, чтобы не осталось выпавших волос, чтобы предотвратить загрязнение раны. Затем продезинфицируйте операционное поле 70% этанолом/хлоргексидином/бетадином и положите мышь в положение лежа головой к хирургу.
- Сделайте шейный разрез по средней линии с помощью препарирующих ножниц.
- Рассеките подчелюстные железы и мышечную ткань шеи и разделите их, чтобы обнажить общую сонную артерию. Используйте в основном тупое рассечение с помощью щипцов.
- Третье место 8-0 шелковые лигатуры ниже правой общей сонной артерии.
- Наложите зажим на проксимальный слой лигатуры и внесите напряжение в артерию, чтобы кровоток приостановился.
- Закройте самую дистальную лигатуру.
- Введите артериальный катетер через небольшое, предварительно сформированное отверстие на черепной поверхности разреза. Сожмите и деформируйте просвет катетера, если он кажется слишком большим, чтобы уменьшить обратный приток крови. Зафиксируйте всеми тремя лигатурами.
- Зафиксируйте катетер на коже, чтобы избежать вывиха. Сделайте это с помощью шовной нити (например, мононити 5-0, нерассасывающейся), которая соединяет катетер с кожей в области предварительно сформированного кожного отверстия.
2. Трахеостомия
- Рассеките предтрахеальную мускулатуру тупо с помощью щипцов.
- Второе место 8-0 шелковые лигатуры под трахеей.
- Трахеотомизируйте с помощью микроножниц как можно проксимальнее, чтобы избежать односторонней вентиляции. Используйте горизонтальную линию разреза между двумя хрящами трахеи.
- Вставьте вентиляционную трубку и зафиксируйте обеими подготовленными лигатурами.
заметка: Проксимальный конец трахеи не нуждается в перевязке.
- Закройте кожу бегущим швом (например, мононитью 6-0, нерассасывающейся).
- Проветрите мышь с частотой 150/мин и дыхательным объемом 200 μл.
3. Индукция смерти мозга (BD)
- Расположите мышь в положение лежа.
- Удалите кожу с черепа с помощью хирургических ножниц и щипцов, чтобы удерживать кожу.
- Пробурить скважину калибра 1 мм парамедиально над левой теменной корой. Прекратите сверление до того, как будет пробита внутренняя компактная кость и твердая мозговая оболочка.
- Проникните в окончательный тканевый мостик черепа с помощью тупых щипцов, удаляя острые края.
- Вставьте баллонный катетер так, чтобы он полностью находился внутри полости черепа. Убедитесь, что воздушный шар предварительно заполнен физиологическим раствором и весь воздух откачался.
- Начните накачивание с ~0,1 мл/мин в течение 10−15 мин (общий объем 0,8−1,2 мл) с помощью шприцевого насоса.<бр/>
заметка: У мыши будет наблюдаться миоклонус, мидриаз, дальнейшая судорожная активность и агональные вздохи.
- Объявите мозг мыши мертвым, как только хвост мыши станет жестким и эрегированным.
заметка: БД подтверждается характерным начальным пиком артериального давления (рефлекс Кушинга), отсутствием рефлексов ствола мозга и спонтанным дыханием. Во время экспериментов следует избегать регулярного тестирования на апноэ, так как у мышей может стать нестабильным кровообращение из-за недостатка кислорода.
- Остановите надувание баллонного катетера.
- Наденьте на мышь одеяло с подогревом, чтобы избежать переохлаждения.
