ПРИМЕЧАНИЕ: Трансгенные линии, использованные в этом исследовании, включают макрофаг-специфичную линию mpeg1:mCherry (сконструированную на месте), нейтрофил-специфичную mpo: GFP, эритроид-специфичную gata1:dsRed и ubiq:secAnnexinV-mVenus, репортер для клеточной смерти (повторно полученный на месте) на фоне дикого типа, перламутра (mitfaw2/w2) и мутантов (BBHm292).
1. День 0: Производство и сбор яиц
- Соберите оплодотворенные эмбрионы от естественного нереста в рассадных боксах, полученных из 1 самца и 1-2 самки взрослых рыбок данио.
заметка: Для протокола аторвастатина могут быть использованы любые дикие/трансгенные животные; Тем не менее, частота кровотечений немного различается между штаммами.
- Инкубируйте 100 эмбрионов при температуре 28 °C в стандартной среде для эмбрионов E3 в чашке Петри и в соответствии со стандартными рекомендациями.
- Через ~6 часов после оплодотворения (HPF) удалите мертвые и неоплодотворенные эмбрионы из чашки с помощью пастеровской пипетки. На рисунке 1 показана временная шкала эксперимента.
2. День 1: Лечение аторвастатином при 24 hpf
- Дехорионатные эмбрионы для лечения аторвастатином с помощью острых, ультратонких рассекционных щипцов. Количество, необходимое для эксперимента, может быть скорректировано соответствующим образом.
- Добавьте 30 мл среды для зародышей Е3 в две чистые чашки Петри. Используйте одну чашку на 100 эмбрионов.
заметка: Если пластины предназначены для культивирования клеток, то дехорионированные данио-рерио на этой ранней стадии часто прилипают ко дну. Чтобы этого избежать, перед использованием тщательно промойте пластины в чистой воде.
- Удалите 60 мкл эмбриональной воды из очистной пластины и добавьте 60 мкл 0,5 мл аторвастатина (ATV). При исходной концентрации 0,5 мМ вышеуказанное разведение приведет к конечной концентрации 1 мкМ, в результате чего ~20% личинок будут некровоточенными (ICH-) и ~80% личинок будут кровоизлитыми (ICH+). Используйте другую пластину для необработанных элементов управления.
заметка: Аторвастатин растворяют в дистиллированной воде (3 мг на 10 мл) с получением 0,5 мМ исходного раствора. Инкубировать в течение ночи при комнатной температуре в темноте с перемешиванием, так как солюбилизация занимает некоторое время. Полная солюбилизация может занять до 1 недели. Не используйте ДМСО (диметилсульфоксид). Раствор аликвотируется и хранится при температуре -20°C. Не замораживать-размораживать.
- С помощью пастеровской пипетки перенесите 100 эмбрионов в как можно меньшем количестве воды на лечебные пластины.
- Инкубируйте планшеты при температуре 28 °C.
заметка: ICH (внутримозговое кровоизлияние) происходит между 33 и 48 hpf. Аторвастатин не нужно удалять, так как инкубация продолжительностью более 24 часов не вызывает дальнейших проблем с развитием.
3. День 2: Разделение популяций ICH- и ICH+ при 50 hpf
- Отделяйте рыбу ICH+ от популяций ICH- и пересаживайтесь на новые блюда для удобства.
- При использовании модели ATV в концентрации 1 мкМ у 75-100% личинок в этот момент времени будет наблюдаться кровоизлияние (ICH+).
заметка: Реакция личинок отличается между штаммами, если личинки не кровоточат с нужной частотой, используйте свежую партию аторвастатина или более высокую концентрацию. Если личинки не проявили кровоизлияния к 48 hpf, то считайте, что они ICH-.
- При использовании модели bbh у всех гомозиготных мутантов будет наблюдаться кровоизлияние на 48 hpf. При использовании гетерозиготного скрещивания гетерозиготные и дикарные братья и сестры ICH-гетерозиготного и дикого типа могут быть использованы в качестве контрольных животных для экспериментов.
- При необходимости обезболить личинок, добавив в среду Е3 0,02% MS222. С помощью пастеровской пипетки отсортируйте личинки на наличие крови в голове в свежие среды Е3. Смотрите рисунок 2.
заметка: Кровь в голове может появляться в переднем, среднем или заднем мозге или в сочетании, а объем кровотечения может варьироваться у разных животных. У мутантов bbh ВМК часто ассоциируется с сильным отеком, который можно распознать по более крупным головам, более широкому пространству между глазами и более диффузному кровотечению. Однако не у всех личинок ICH+ bbh наблюдается отек .
