Иммунофлуоресцентное окрашивание сиалогликопротеинов в нейральных прогениторных клетках и нейронах

Аннотация

Источник: Bai, Q., et al., Идентификация маркеров клеточной поверхности первичных нейральных стволовых и прогениторных клеток с помощью метаболического мечения сиалогликана. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует биотинилирование и флуоресцентное мечение модифицированных сиалогликопротеинов в первичных нейральных стволовых и прогениторных клетках, а также нейронах, а также их визуализацию с помощью флуоресцентной микроскопии.

Протокол

1. Иммунофлуоресцентное окрашивание сиалогликопротеинов в расширенных первичных НСПК и дифференцированных нейронах

1. Приготовьте комплекс BTTAA-CuSO₄ 1 30x stock, содержащий 1,5 мМ CuSO₄ и 9 mM BTTAA в воде двойной дистилляции. Приготовьте свежеконъюгированный биотин-конъюгированный буфер 1, содержащий 50 мкМ биотин-алкина, 2,5 мМ аскорбата натрия и 1x комплекс BTTAA-CuSO₄ в PBS.
2. Извлеките вкладыши из планшетов для совместного культивирования. Отсадите питательную среду из донных лунок и промойте нервные клетки один раз предварительно подогретым PBS.
3. Отсасывайте PBS из лунок. Добавьте в ячейки 1 мл предварительно охлажденного 4% раствора параформальдегида PBS на лунку и зафиксируйте их при ОТ на 10 мин. Затем промойте клетки 3 раза с предварительно охлажденным PBS.
4. Отсадите PBS из лунок и добавьте в клетки 1 мл свежеприготовленного биотин-конъюгированного буфера 1 лунку. Инкубируйте клетки при РТ в течение 10 минут.
5. Аспирируйте реакционный буфер из лунок. Промойте ячейки 3 раза с PBS. Приготовьте окрашивающий буфер, содержащий 1% FBS и 1 мкг/мл Alexa Fluor 647-стрептавидина. Добавьте 1 мл красящего буфера на лунку в клетки и инкубируйте клетки при RT в течение 30 минут.
6. Отсадите буфер для окрашивания из лунок и промойте ячейки 3 раза предварительно охлажденным PBS. Приготовьте блокирующий буфер, содержащий 5% БСА и 0,3% неионогенного детергента-100 в PBS. Добавьте в клетки 1 мл блокирующего буфера на лунку и инкубируйте при RT в течение 10 минут.
7. Приготовьте первичный раствор антитела путем разведения антител против нестина и анти-β-тубулина III в блокирующем буфере в соотношении 1:20 и 1:1000 соответственно. Удалите блокирующий буфер из лунок и добавьте в клетки 1 мл раствора первичного антитела на лунку. Инкубируйте клетки при температуре 4 °C в течение ночи.
8. Удалите первичный раствор антител из лунок. Промойте клетки 3 раза с помощью предварительно охлажденного PBS. Приготовьте вторичный раствор антитела, разбавив Alexa Fluor 488 козий антимышиный IgG1, козий антимышиный IgG2b Alexa Fluor 546 и DAPI в блокирующий буфер в соотношении 1:1000. Отсадите PBS из лунок и добавьте в клетки 1 мл раствора вторичного антитела на лунку. Инкубируйте клетки при РТ в течение 2 ч.
9. Отсадите раствор антитела из лунок и промойте клетки 3 раза предварительно охлажденным PBS. После этого клетки готовы к захвату изображения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	10099141	10%
Параформальдегид	сигма	158127	4%
DAPI	Gibco	No 62248
6-луночный планшет	Корнинг	No 3335
Мышиный моноклональный анти-Нестин	Исследование развития Банк гибридома	Крыса-401	от 1 до 20
Мышиный моноклональный анти-бета-тубулин III	сигма	Т8860	1 к 1000
Alexa Fluor 488 козий антимышиный IgG1	Инвитроген	А-21121	1 к 1000
Alexa Fluor 546 козий антимышиный IgG2b	Инвитроген	А-21143	1 к 1000
Тритон Х-100	Амреско	Номер 694
Медный купорос	сигма	209198
Алкин-биотин	Нажмите «Инструменты химии	ТА105
БТТАА	Нажмите «Инструменты химии	1236
Аскорбат натрия	сигма	А4034
Alexa Flour 647-конъюгированный стрептавидин	Инвитроген	С21374	1 к 1000

» » г.