Оценка in vitro агрегированного амилоида-β коллапса колбочек роста нейронов

Аннотация

Источник: Kuboyama, T. Визуализация коллапса аксонального роста и эффектов раннего амилоидного β в культурных нейронах мыши. J. Vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует in vitro оценку колбочки роста нейронов агрегатами амилоид-β (Aβ). Обработка нейронов агрегатами Aβ вызывает дестабилизацию цитоскелета, что приводит к коллапсу конусов роста на кончиках аксонов. Обработанные клетки сравнивают с контрольными клетками для оценки степени коллапса конуса роста.

Протокол

1. Анализ коллапса

1. Поли-D-лизин cотинг
   1. Покройте 8-луночные культуры 400 мкл поли-D-лизина (PDL) 5 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (PBS) и инкубируйте их при 37 °C в течение ночи.
   2. Удалите раствор PDL и промойте лунки 3 раза дистиллированной водой.
2. Культура нейронов
   1. Измельчите свежевыделенные коры головного мозга эмбриональных мышей на 14-й день (E14) ddY (Deutschland, Denken, and Yoken) с помощью микроножниц в питательной среде для нейронов, содержащей 12% лошадиной сыворотки, 0,6% глюкозы и 2 мМ L-глутамина (среда А). Не добавляйте антибиотики.
      заметка: В этом протоколе используется мышь ddY. Это беспородная порода, широко используемая в Японии. Этот протокол культивирования нейронов также может быть применен к корковым нейронам крыс.
   2. Центрифугируйте ткани при давлении 87 x g в течение 3 минут.
   3. Удалите надосадочную жидкость. Затем в гранулу добавьте 2 мл 0,05% трипсина и инкубируйте в течение 15 минут при 37°C. Перемешивайте, постукивая каждые 5 минут.
   4. Добавьте 4 мл среднего А и перемешайте, постукивая.
   5. Центрифугируйте ткани при давлении 178 x g в течение 3 минут.
   6. Удалите надосадочную жидкость и инкубируйте ткани с 600 Ед/мл дезоксирибонуклеазы I (ДНКазы I) и 0,3 мг/мл ингибитора трипсина соевых бобов, растворенных в PBS в течение 15 минут при 37 °C. Перемешивайте, постукивая каждые 5 минут.
   7. После инкубации добавьте 4 мл среды А и перемешайте постукиванием.
   8. Центрифугируйте ткани при давлении 178 x g в течение 3 минут.
   9. После удаления надосадочной жидкости добавьте 4 мл среды А и растирайте ткани полированной пастеровской пипеткой.
   10. Отфильтруйте растиранные ткани с помощью ячейки размером с пор 70 мкм. После фильтрации рассчитайте плотность клеток с помощью гемоцитометра.
   11. Культивируют клетки в 8-луночном культуральном стекле в соотношении 0,8 x 10⁴ клетки/лунку со средним А и поддерживают их в инкубаторе CO₂ с увлажненной атмосферой 10% CO₂ при 37 °C.
   12. Через 4 ч культивирования замените питательную среду на ту, которая содержит 2% добавки для культуры нейронов, 0,6% глюкозы и 2 мМ L-глутамина (среда B).
       заметка: Чистота нейронов составила примерно 75%, как описано ранее.
3. Пробирный анализ коллапса
   1. Коммерчески полученный полноразмерный амилоид β1-42 (Aβ1-42) растворить в дистиллированной воде в концентрации 0,5 мМ и инкубировать при 37 °С в течение 7 суток. После инкубации агрегированный раствор Aβ1-42 хранить в морозильной камере при температуре -30 °C до использования.
      заметка: Эта инкубация необходима для агрегации и токсичности Aβ.
   2. После 4 дней культивирования нейронов обработать лунки 100 мкл новой среды В, содержащей 0,5 мкМ агрегированного Aβ1-42 или раствора носителя (дистиллированной воды) в течение 1 ч.<бр/> заметка: Эффекты Aβ1-42 были дозозависимо увеличены с 0,1 до 5 мкМ и достигли пика на уровне 0,5 мкМ, как описано ранее. Аналогичные результаты могут наблюдаться при лечении Aβ1-42 в течение 1 ч после 3 дней культивирования нейронов.
   3. Удалите питательную среду и немедленно зафиксируйте нейроны 4% параформальдегидом, содержащим 4% сахарозы в PBS, на 1 ч при 37 °C на горячей пластине.
   4. После фиксации 3 раза промойте нейроны PBS и смонтируйте их с помощью водной монтажной среды. Сушите монтажный материал при температуре 4 °C в течение 2–4 дней.
   5. Захватите всю площадь (7,8 x 9^мм2) каждой лунки с помощью 20-кратного сухого объектива на инвертированном микроскопе.
   6. Классифицируйте самые длинные нейриты каждого нейрона на стадии 3 или 4 как аксоны, как описано ранее.
   7. Классифицируйте конусы роста в соответствии со следующими критериями: 1) аксональные конусы роста без ламелиподий или 2) имеющие менее трех филоподий, считаются коллапсированными конусами роста, как описано ранее.
      заметка: Здоровые шишки роста оцениваются как 0 баллов; Свернутые шишки роста оцениваются как 1 балл. Для каждой процедуры рассчитывается средний балл коллапса.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
мыши ddY	СЛЦ
Восьмилуночное культуральное стекло	сокол	354108
поли D лизин	Вако	168-19041
Питательная среда, Нейробазальная среда	Gibco	No 21103-049
Сыворотка для дома	Gibco	26050-088
глюкоза	Вако	049-31165 (Английский)
L-глютамин	Вако	074-00522 (Английский
0,05% трипсина	Gibco	No 25300-054
ДНКаза I	Уортингтон	ДП
ингибитор трипсина сои	Gibco	17075-029
Фильтр с размером ячеек 70 мкм, сетчатый фильтр	сокол	No 352350 (Английский
Добавка к B-27	Gibco	17504-044
Инкубатор CO2	Компания Astec	ССА-165ДС
Амилоид β1-42	Сигма-Олдрич	А9810
параформальдегид	Вако	162-16065
сахароза	Вако	196-00015 (Английский
Водная среда для монтажа, AquaPoly/Mount	Полинауки	18606-20
Инвертированный микроскоп А	Карл Цейсс	Axio Observer Z1	Подключается к AxioCam MRm, нагревательному блоку XL S, модулю CO2 S1 и модулю TempModule S1
Объектив План-Апохромат 20х	Карл Цейсс	420650-9901

гг. ) ) ) гг.