Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Подготовка срезов тканей для визуализационной масс-спектрометрии (IMS)
- Обработка образца ткани человека, вскрытого в мозге
заметка: Убедитесь, что на этапе подготовки образца для IMS сохраняется исходное состояние ткани. Избегайте загрязнения и посмертных изменений. Следующий шаг имеет решающее значение.
- Получите образцы коры головного мозга человека для IMS из мозга, который был удален, обработан и сохранен при -80 °C в течение 8 часов после смерти. Возьмите образец мозга из затылочной коры пациентов с болезнью Альцгеймера (БА) и контрольной группы соответствующего возраста.
- Подготовка замороженных срезов тканей
- Разрежьте срезы ткани на криостате. Поместите проводящие стекла микроскопа с покрытием из оксида индия и олова (ITO) внутрь криостата.
- Нагрейте образец мозга для аутопсии с -80 °C до -22 °C внутри криостата.
- Прикрепляйте к криостату новое одноразовое лезвие для каждого эксперимента. Всегда старайтесь использовать чистую часть лезвия.
- Поместите замороженные мозги вскрытия на сцену вместе с небольшим количеством компаунда оптимальной температуры резки (ОКТ) (достаточно, чтобы покрыть центральную область сцены; см. Таблицу материалов).
- Выберите условия для тонкой резки. Для IMS используйте толщину 10–12 мкм для срезов мозга человека. Для ИМС и иммуногистохимии (ИГХ) вырежьте пять-шесть срезов из каждого образца ткани.
- Когда лезвие только начинает резать ткань, поверните колесо и «повернитесь» к блоку до тех пор, пока вся ткань не будет обнажена. Если на срезе есть небольшая полоса или разрыв, подождите еще немного в криостате, пока регулировка температуры автоматически не исправит это. Посчитайте несколько секунд, прежде чем открыть антиролл с салфеткой под ним.
- Немедленно поместите срез ткани на сторону предметного стекла с покрытием ITO. Разморозьте срез ткани, положив палец под предметное стекло на стороне без покрытия ITO. Ткань будет прилипать к предметному стеклу; Следите за тем, чтобы ткань была как можно более ровной и без складок. Выполните этот шаг при комнатной температуре.
заметка: Наденьте перчатки, маски и лабораторный халат, так как человеческие образцы могут содержать биологические загрязнители. Когда все срезы будут сделаны за день, очистите криостат, щетки и патроны лабораторными салфетками и 200 мл 100% этанола.
- Промывание участков ткани
- Погрузите образцы в 40–100 мл 70% этанола на 30 с для удаления эндогенных липидов и неорганических солей. Используйте стеклянную банку для окрашивания.
- Промойте образцы 40–100 мл 100% этанола в течение 30 с, 40–100 мл раствора Карноя в течение 3 мин, 40–100 мл 100% этанола в течение 30 с, 40–100 мл 0,1% трифторуксусной кислоты (ТЖК) в течение 1 мин и 40–100 мл 100% этанола в течение 30 с. Используйте банку для окрашивания стекла.
заметка: Раствор Карноя представляет собой фиксатор, состоящий из шести частей этанола, трех частей уксусной кислоты и одной части хлороформа.
- Сушите в вакууме в течение 30 минут.
- Обработка срезов тканей парами муравьиной кислоты для лучшей ионизации белков Aβ из тканей мозга при аутопсии
- Подготовьте печь и предметное стекло для инкубации, которые будут использоваться для последующей вапоризации 5 мл 100% муравьиной кислоты. Для достижения удовлетворительной кислотной обработки поддерживайте влажность воздуха в инкубационной стеклянной чашке на уровне насыщения на протяжении всего этого этапа и поддерживайте температуру на уровне 60 °C. Поместите салфетки в инкубационную стеклянную чашку, избегая погружения в муравьиную кислоту, и обрабатывайте в течение 6 минут.
- Сделайте оптическое изображение образцов с помощью пленочного сканера, сканера геля, цифрового микроскопа и т. д. Выполните этот шаг при комнатной температуре. Юстировка оптического изображения образцов необходима, когда мишень для образца помещается внутрь прибора. Как правило, распознать участок ткани под матриксным слоем не представляется возможным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наиболее удобным способом получения оптического изображения является использование офисного сканера. Рекомендуется сохранить изображение в папке для хранения данных изображений.
- Чтобы соотнести оптические изображения с образцами, сделайте направляющие метки, которые видны как на оптическом изображении, так и под матричным слоем в оптике камеры. Самый простой способ — заметить как минимум три метки корректирующей жидкости вокруг образца перед получением оптического изображения.
- Матричное приложение
- Приготовление матричного раствора
- В микропробирке, устойчивой к органическим растворителям, приготовьте раствор синапиновой кислоты (SA) в концентрации 10 мг/мл в 50% ацетонитриле (ACN) и 0,1% TFA. Тщательно растворите состав SA с помощью вортекса или кратковременной ультразвука в течение 10 минут. Хранить раствор при комнатной температуре до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует три различных варианта матричного распыления: с помощью аэрографа, ультразвукового распылителя или автоматического распылителя.
- Распыление матрицы аэрографом
- Выполняйте операцию при постоянной комнатной температуре (20–23 °C) и влажности (40–60%). Параметры, которые необходимо настроить для оптимального распыления, включают размер капли, количество тумана, угол и расстояние между распылительной форсункой и тканевой частью, а также температуру и влажность в лаборатории. Отрегулируйте эти условия, проверив результаты микроскопии.
заметка: Поскольку ограничивающими факторами являются размер кристаллов и однородность покрытия матрицы, а также нежелательная миграция/диффузия аналитов, чем меньше, тем лучше размер капли. Однородность также является точкой проверки.
- Напыление матрицы ультразвуковым распылителем
- Извлеките распыляемую ткань из эксикатора и поместите ее в камеру. Убедитесь, что салфетка не закрывает окно датчика.
- Начните подготовку, нажав кнопку «Старт»; обычно время подготовки составляет около 90 минут. Подготовка будет регулироваться автоматически с помощью контроля толщины и влажности слоя матрицы. После завершения подготовки снимите предметное стекло и храните его в эксикаторе в течение 15 минут, прежде чем считывать его в приборе MALDI.
- Очистите распылитель 2–3 мл 100% метанола (MeOH) до тех пор, пока распылительная головка не станет чистой.
заметка: Мелкодисперсный туман из матричных капель проникает в ткань с помощью гравитационного листа. Образуется средний размер капель 20 мкм; Диаметр всех капель составляет менее 50 мкм.
- Распыление матрицы с помощью автоматического распылителя
- Распылите матричный раствор на поверхность ткани с помощью автоматического распылителя. Постоянный поток нагретого газа оболочки (N2, установленный на 10 фунтов на квадратный дюйм и 75 °C) будет подаваться одновременно с распылением матричного раствора. Используйте систему насоса для растворителей (установленную на 10 фунтов на квадратный дюйм и 0,15 мл/мин) для подачи матричного раствора.
заметка: Самое главное, работайте под защитным шкафом, чтобы избежать вдыхания матричных аэрозолей. Контролируйте температуру и влажность в помещении для воспроизведения однородной кристаллизации матрицы.
2. MALDI-IMS
- Выполнение сверхскоростной масс-спектрометрии.
- Проводите эксперименты с высокой пропускной способностью и пространственным разрешением с помощью MALDI-IMS, оснащенного лазером на иттрий-алюминиевом гранате с частотой 10 кГц, легированным неодимом (Nd:YAG, 355 нм).
- Для масс-спектрометрических измерений определите участки тканей с помощью управляющего программного обеспечения MALDI и программного обеспечения для анализа данных.
- Получение спектров в положительном линейном режиме с диапазоном масс м/з 2 000–20 000 и пространственным разрешением 20 и 100 мкм.
- Чтобы изготовить калибровочный стандарт, растворите калибровочный стандарт пептида и калибровочный стандарт белка в соотношении 1:4 с альфа-циано-4-гидроксил-коричной кислотой (CHCA) в растворе TA30 (ACN: 0,1% TFA = 30:70), а затем разбавьте его в 10 раз. Поместите 1 мкл калибровочного стандарта на предметное стекло в четырех разных местах.
- Используя программное обеспечение для молекулярной гистологии (см. Таблицу материалов), наложите несколько отдельных изображений, чтобы найти пространственную корреляцию различных сигналов, таких как колокализация различных пептидов Aβ в старческих бляшках (SP) и стенках артерий.
