Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Материалы
- Приготовление инъекций липополисахарида (ЛПС)
- Добавьте 25 мл дистиллированной воды к 25 мг порошка ЛПС, полученного из Salmonella typhimurium, до конечной концентрации 1 мг/мл. Хранить инъекцию в стерильной пробирке при температуре 4 °C.
осторожность: ЛПС токсичен.
- Приготовьте 2% раствор синего Эванса (EB) в обычном 0,9% физиологическом растворе, чтобы сохранить рабочую концентрацию инъекции EB.
2. Животные
Введение ЛПС самцам крыс Спраг-Доули (SD) в возрасте 10 недель (средний вес: 280 ± 20 г) путем внутрибрюшинной инъекции.
осторожность: Если крысы приобретаются у другой организации, то адаптационная фаза не должна быть меньше 7 дней.
3. Впрыски LPS
- Внутрибрюшинно ввести ЛПС каждой крысе в дозе 1 мг/кг и вернуть крыс в их домашнюю клетку.
заметка: Анестезия не требуется.
- Через шесть часов введите крысам ту же дозу инъекции ЛПС.
- Через шестнадцать часов введите крысам ту же дозу ЛПС><.
осторожность: Введение крысам SD ЛПС в дозе 1 мг/кг может привести к 5% смертности. Уровень смертности может еще больше увеличиться у молодых или старых крыс или беременных самок крыс.
- Верните крыс в клетки после инъекции ЛПС и обеспечьте свободный доступ к еде и питью.
заметка: У крыс будет проявляться отчетливая системная воспалительная реакция, и поэтому важно, чтобы клетки оставались чистыми на протяжении всего эксперимента. Крысы должны часто (2 раза в день) следить за весом, общим внешним видом и отношением после первой инъекции ЛПС. Если крысы начинают демонстрировать сгорбленную осанку, нежелание двигаться, значительную потерю веса (>20%), окрашивание порфирином, их следует гуманно усыпить до 7-дневной конечной точки исследования БЭ.
4. Сбор образцов
- Инъекция EB
- Через семь дней после первой инъекции обезболите крысу внутрибрюшинно в соответствии с утвержденным протоколом IACUC.
- Подождите 1–2 минуты, пока у крыс не перестанут проявляться рефлекторные реакции роговицы. Проведите сердечную пункцию глубиной 5–8 мм каждой крысе; Точка прокола должна находиться на расстоянии 5 мм к левому краю грудины в 3-м и 4-м межреберье.
- Дождитесь восстановления крови, а затем введите БЭ в дозе 0,2 мл/100 г массы тела в левый желудочек сердца.
осторожность: Пункция сердца и инъекция БЭ должны быть выполнены с осторожностью. БЭ может быть введен в грудную полость или перикард, а не в левый желудочек сердца.
- Отсосите пустую трубку и замените этот объем трубкой EB перед инъекцией, чтобы снизить частоту неудач (например, ошибочная инъекция в грудную клетку).
- Подержите крысу в лежачем положении в течение 10 мин.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец не используется для обнаружения утечки БЭ при иммунофлуоресцентной визуализации, то этот шаг может быть пропущен.
- Общая наблюдательность
- Выполняйте сердечную перфузию с использованием ледяного 1 М фосфатного буферного раствора (PBS) для очистки церебральной сосудистой сети и мозга.
- С помощью скальпеля сделайте надрез брюшной полости по всей длине диафрагмы.
- Прорежьте ребра слева от средней линии грудной клетки.
- Откройте грудную полость. Используйте зажимы для обнажения сердца и облегчения дренажа крови и других жидкостей.
- Неуклонно удерживая сердце щипцами (сердце все еще должно биться), непосредственно введите иглу в выступ левого желудочка, чтобы удлинить его примерно на 5 мм. Закрепите иглу в этом положении, зажав рядом с точкой входа.
осторожность: Не стоит чрезмерно удлинять иглу, так как она может проколоть внутреннюю стенку и нарушить циркуляцию растворов.
- Отпустите клапан, чтобы обеспечить поток ледяного раствора PBS (200–300 мл) с медленной и постоянной скоростью около 20 мл/мин с помощью перфузионного насоса. Если животные требуют фиксации вместо грубого наблюдения, то используют ту же дозу ледяного 0,9% физиологического раствора.
- С помощью острых ножниц сделайте надрез в предсердии, следя за тем, чтобы раствор непрерывно тек. Если жидкость не течет свободно или выходит из ноздрей или рта животного, измените положение иглы.
- Скрининг на CMH по валовому наблюдению.
заметка: Если выборка не используется при вычислении количества CMH по валовому наблюдению, то этот шаг может быть пропущен.
- фиксация
- Выполняйте перфузии сердца с использованием ледяного 0,9% физиологического раствора (200–300 мл) для очистки сосудов головного мозга и сосудов головного мозга.
- Выполняйте перфузии сердца с использованием ледяного 4% параформальдегида для фиксации.
- Обезглавьте крысу, изолируйте мозг и погрузите мозг в 20% раствор сахарозы не менее чем на 6 ч.
- Поменяйте раствор на 30% сахарозу и зафиксируйте еще на 6 ч.
- Подготовьте срезы тканей мозга толщиной 10 мм с помощью криостата.
5. Окрашивание гематоксилином и эозином (HE)
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура выполняется с использованием набора для окрашивания HE.
- Промойте горки в дистиллированной воде.
- Закрасить в растворе гематоксилина на 8 мин. Постирать в проточной воде из-под крана 5 мин.
- Дифференцировать в 1% кислотном спирте в течение 30 с. Промыть в проточной воде из-под крана в течение 1 мин.
- Окрасить в 0,2% аммиачную воду (Bluing) или насыщенный раствор карбоната лития на срок от 30 с до 1 мин. Промыть в проточной водопроводной воде в течение 5 мин.
- Промойте в 95% спирте (10 погружений).
- Противопятните раствором эозина от 30 с до 1 мин.
- Обезвоживайте через 95% спирт, две смены абсолютного спирта, в течение 5 мин каждая.
- Очистить в ксилоле в течение 30 с.
- Монтируйте по методу Лю.
- Анализ с помощью светлопольного флуоресцентного микроскопа.
заметка: Эритроциты, высвобождающиеся из кровеносных сосудов, которые являются компонентами КМГ, появляются в красно-оранжевом цвете при окрашивании HE.
