$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Первичная культура клеток гиппокампа
- Приготовьте диссоциированную культуру клеток гиппокампа крысы на 19-й день эмбрионального периода. Пластины ТОТЭ на 12 мм покровных стеклах, покрытых полиэтиленамином (ПЭИ) в 24-луночных чашках с плотностью 50 000 - 60 000 ячеек/лунка. Проверьте плотность с помощью камеры подсчета ячеек и фазово-контрастной оптики.
- Культивируйте нейроны в течение 3 дней (день in vitro (DIV) 3) в 24-луночном планшете в инкубаторе при 37 °C с 5%CO2.
- Оцените покровные стекла по показателям здоровья клеток с помощью микроскопии в проходящем свете (например, фазово-контрастной оптики при увеличении 10 - 20X). Проверьте следующие показатели хорошего здоровья: четкий фазовый контрастный ореол, нейриты без бусинчатых структур, а также отсутствие кластеризации сомы или связывания нейритов.
2. Трансфекция
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол относится к двойной трансфекции для 3 лунок. Тем не менее, протокол работает лучше всего, когда подготовлено количество, достаточное для 4 лунок.
- Приготовьте 500 мл трансфекционного буфера (274 мМ натрия хлорида, NaCl, 10 мМ хлорида калия, KCl, 1,4 мМ динатрия гидрофосфата, Na2HPO4, 15 мМ глюкозы, 42 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтанасульфоновой кислоты, HEPES) в колбе Эрленмейера.
- Растворите 8,0 г NaCl, 0,37 г KCl, 0,095 г Na2HPO4, 1,35 г глюкозы и 5,0 г HEPES в 400 мл дистиллированной воды в колбе Эрленмейера.
- Отрегулируйте pH до 6,95 с помощью 1 М гидроксида натрия, NaOH с помощью pH-метра.
- Отрегулируйте объем дистиллированной воды до 500 мл и проверьте pH с помощью pH-метра.
- Изготовьте 20 - 30 мл аликвот трансфекционного буфера со следующими значениями рН путем пипетирования 1 М NaOH в трансфекционный буфер: 6,96, 6,97, 6,98, 6,99, 7,00, 7,01, 7,02, 7,03, 7,04, 7,05, 7,06, 7,07, 7,08, 7,09, 7.11.<бр />
ПРИМЕЧАНИЕ: pH буфера для трансфекции имеет решающее значение для эффективности трансфекции.
- Чтобы проверить, какой буфер для трансфекции приводит к наибольшему количеству трансфицированных клеток, проверьте каждое значение pH от 6,96 до 7,11. Используйте метод трансфекции, описанный в пунктах 2.2 - 2.11, и валидированную плазмиду, экспрессирующую зеленый флуоресцентный белок (GFP). Определите количество трансфицированных клеток на покровное стекло для каждого значения pH трансфекционного буфера, чтобы оценить, какой буфер работает лучше всего.
- Возьмите буфер с наибольшей эффективностью трансфекции в микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл. Заморозьте и храните пробирки при температуре -20 °C.
- Предварительно подогрейте восстановленную сывороточную среду, среду для клеточных культур и дистиллированную воду до 37 °C на водяной бане.
- Приготовьте трансфекционную смесь в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Работайте под ламинарным колпаком для обеспечения стерильных условий работы.
- Смешайте 7,5 мкл 2 М хлорида кальция с 4 мкг каждой свободной от эндотоксина ДНК (Synaptophysin-mOrange и mGFP/GFP-Rogdi). Добавьте воду до общего объема 60 мкл в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл.
- Добавьте в смесь 60 мкл буфера для трансфекции. Для получения наилучших результатов добавляйте буфер для трансфекции по каплям, осторожно встряхивая смесь ДНК на вихре.
- Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 20 минут. Избегайте встряхивания инкубационной трубки во время инкубации, поместив трубку рядом с колпаком ламинарного потока.
- Под ламинарным проточным колпаком извлеките из лунок среду для культивирования клеток («кондиционированную среду») с помощью пипетки объемом 1000 мкл и храните ее в отдельной емкости в инкубаторе.
- Добавьте по 500 мкл восстановленной сыворотки в каждую лунку. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5%CO2 до окончания 20-минутного инкубационного периода (шаг 2.3.3).
- Добавьте по 30 мкл трансфекционной смеси в каждую лунку, пипетируя несколько капель. Выбросьте остатки на дно пробирки.
- После того, как все лунки будут снабжены трансфекционной смесью, осторожно встряхните 24-луночную пластину, чтобы обеспечить распределение трансфекционной смеси в среде.
- Инкубируйте лунки в течение 60 минут при температуре 37 °C и 5%CO2.
- Извлеките и выбросьте смесь для трансфекции и трижды промойте ее средой для клеточных культур. Добавьте по 1 мл среды для клеточных культур в каждую лунку и инкубируйте их в течение 30 секунд при RT. Удалите 750 мкл среды и добавьте столько же свежей среды. Повторите это три раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этап стирки имеет решающее значение. Сведите к минимуму время, в течение которого в каждой лунке нет среды (т.е. вынимайте и заменяйте колодец за колодцем) и аккуратно добавляйте промывочную среду.
- Удалите и выбросьте среду для культивирования клеток и добавьте 450 мкл кондиционированной среды поочередно.
- Дайте нейронам созреть в инкубаторе при 37 °C и 5%CO2 до DIV 10.
3. Стимуляция и поглощение Syt1
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол применяет поглощение к 3 скважинам. Для деполяризации любого другого количества лунок отрегулируйте объемы соответствующим образом.
- Приготовьте 50 мл 10-кратного деполяризационного буфера (640 мМ NaCl, 700 мМ KCl, 10 мМ хлорида магния, MgCl2, 20 мМ хлорида кальция, CaCl2, 300 мМ глюкозы, 200 мМ HEPES, pH 7,4) в колбе Эрленмейера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Деполяризационный буфер можно хранить при температуре 4 °C в течение нескольких недель. Если также используется недеполяризующий раствор, приготовьте 10-кратный раствор Tyrode's, состоящий из 1290 мМ NaCl, 50 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 20 мМ CaCl2, 300 мМ глюкозы, 200 мМ HEPES pH 7,4, чтобы сравнить рециркуляцию, вызванную стимуляцией, со спонтанной рециркуляцией. После разведения до 1x добавьте 1 мкМ тетродотоксина перед использованием, чтобы блокировать генерацию потенциала действия.
- В 50 мл дистиллированной воды в колбе Эрленмейера растворить 1,87 г NaCl, 2,61 г KCl, 0,1 г MgCl2-6H 2O, 0,15 г CaCl2-2H 2O и 3,0 г глюкозы-1 H2O и 2,38 г HEPES. Отрегулируйте pH с помощью NaOH и стерильно отфильтруйте раствор. Разбавьте буфер в соотношении 1:10 в дистиллированной воде до концентрации 1x.
- Приготовьте 4% параформальдегид (PFA) в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS) (pH 7,4) для фиксации после стимуляции.
- Для 500 мл 4% PFA в 1x PBS растворите 20 г параформальдегида в 450 мл дистиллированного H2O.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нагревание раствора может ускорить растворение, но не нагревайте раствор выше 70 °C, так как PFA может распадаться.
осторожность: ПФА токсичен, потенциально канцерогенен и тератогенен. При работе с PFA, работайте под вытяжным шкафом и избегайте проглатывания.
- Дайте раствору остыть до температуры RT и добавьте 50 мл 10x PBS стокового раствора. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью NaOH/HCl (соляной кислоты) с помощью pH-метра.
- Предварительно нагрейте 600 мкл 1x деполяризационного буфера и 10 мл среды для клеточных культур до 37 °C на водяной бане.
- Добавьте 1 мкл мышиного антитела к Syt1 (клон 604.2) в 1-кратный буфер для деполяризации и заведите его в течение 10 секунд.
- Удалите и выбросьте питательную среду для клеточных культур из клеток. Добавьте по 200 мкл смеси деполяризационных антител в каждую лунку и инкубируйте в течение 5 минут при 37 °C и 5%CO2 в инкубаторе.
- Удалите и выбросьте смесь деполяризационных антител и промойте ее три раза средой для культивирования клеток. Добавьте по 1 мл среды для культивирования клеток в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 секунд при RT. Удалите 750 мкл среды и добавьте такое же количество свежей среды. Повторите три раза.
- Удалите и выбросьте среду для культивирования клеток и добавьте 300 мкл 4% PFA в 1x PBS. Выдерживать 20 минут при температуре 4 °C.
- Постирайте три раза по 5 минут каждый с 1x PBS. <чел/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.
4. Иммуноцитохимия
- Подготовьте 50 мл блокирующего буфера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирующий буфер может храниться при температуре -20 °C в течение нескольких месяцев.
- Растворите 2,5 г сахарозы и 1 г бычьего сывороточного альбумина (БСА) в 5 мл 10-кратного исходного раствора PBS. Добавьте 1,5 мл 10% раствора моющего средства. Перемешайте раствор до тех пор, пока все компоненты не растворятся должным образом, и добавьте дистиллированный H2O до достижения конечного объема 50 мл. Аликвотируем раствор и замораживаем аликвоты для хранения.
- Разведите вторичное антитело, связанное с флуорофором (направленное против первичной формы антитела Syt1) в 200 мкл блокирующего буфера в каждой лунке в разведении 1:1000.
- Извлеките и выбросьте 1x PBS из каждой лунки, содержащей покровную крышку.
- Добавьте 200 мкл смеси блокирующего буфера и антител в каждую лунку и инкубируйте в течение 60 минут при RT.
осторожность: Поскольку вторичные антитела чувствительны к свету, все дальнейшие действия должны выполняться в темноте.
- После инкубации промойте клетки трижды в течение 5 минут 1 мл 1x PBS.
- Заложите покровные стекла на предметные стекла микроскопа с помощью закладного материала.
- Добавьте каплю засадочной среды объемом 7 мкл на предметное стекло микроскопа. Снимите покровное стекло с 24-луночного планшета, подняв его с помощью шприца и захватив щипцами.
осторожность: Ячейки на поверхности покровного стекла легко повредить, поэтому обращаться с щипцами нужно осторожно.
- Опустите покровную салфетку в дистиллированную воду, чтобы удалить PBS, и осторожно высушите ее, прикоснувшись одним краем к мягким тканям.
- Переверните покровное стекло на каплю встраиваемой среды так, чтобы поверхность, несущая клетки, была обращена к предметному стеклу микроскопа, тем самым встраивая клетки в встраиваемую среду.
- Дайте предметным стеклам высохнуть под колпаком на 1 - 2 часа (накройте их во избежание воздействия света) и храните их в предметной коробке микроскопа при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.