Иммуноокрашивание нейронов, обработанных агрегатами альфа-синуклеина

Аннотация

Источник: Panattoni, G., et al. Экзогенное введение связанных с микросомами агрегатов альфа-синуклеина в первичные нейроны в качестве мощной клеточной модели образования фибрилл. J. vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует иммуноокрашивание нейронов, обработанных агрегатами альфа-синуклеина (αS). Сначала нейроны обрабатываются αS-агрегатами. Затем они фиксируются, проникают и обрабатываются блокирующим раствором. Добавляются первичные антитела, за которыми следуют флуоресцентно меченные вторичные антитела и ядерный краситель. Затем образец монтируется и рассматривается под микроскопом.

Протокол

1. Лечение нейронов

Примечание: Обработка была проведена в Отделе (DIV) 7. Все этапы проводятся под колпаком для клеточных культур в стерильных условиях. Пример плотности культуры нейронов коры головного мозга в DIV 7 показан на рисунке 1.

1. Объединение ассоциированных микросомами агрегатов αS, полученных из спинного мозга трех различных больных трансгенных мышей, для получения раствора 1 мкг/мкл, с использованием оригинального гомогенизационного буфера [состоящего из 250 мМ сахарозы, 20 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновая кислота), 10 мМ KCl (хлорид калия), 1,5 мМ MgCl₂ (хлорид магния), 2 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), и 1x ингибиторы фосфатазы/протеазы] для разведения.
2. Возьмите культуру нейронов на покровных стеклах поли-D-лизина в 24 луночных планшетах, содержащих среду (2% B27, 10x гентамицин и 2 мМ глутамина). Удалите 1/3 среды и аккуратно замените ее свежей средой, содержащей 2% B27, 1x гентамицин и 2 мМ глутамина.
3. Добавьте 1 г объединенных микросом-ассоциированных агрегатов альфа-синуклеина (αS) в клеточную среду. Верните нейроны в инкубатор при температуре 37 °С.
4. Каждые 3 дня в течение 1 недели добавляйте 1/3 свежей среды. Не заменяйте носитель. Просто добавьте его.
5. Через 1 неделю лечения удалите 1/3 среды и аккуратно замените ее свежей средой, содержащей 2% B27, 10 мкг/мл гентамицина и 2 мМ глутамина. Повторяйте каждые 3 дня.
6. Зафиксируйте нейроны через 2 недели лечения (DIV 21).

2. Иммунофлюоресценция

1. Зафиксируйте нейроны с помощью 2% параформальдегида в фосфатно-солевом буфере (PBS) 1x и 5% растворе сахарозы в течение 15 минут при комнатной температуре (RT) без встряхивания под химическим вытяжным шкафом.
2. Удалите фиксирующий раствор. Кратко вымыть PBS 1x, 3 раза.
   заметка: Выполняйте все этапы стирки аккуратно, потому что первичные нейроны не прилипают прочно к полилизиновым покровным стеклам.
3. Пермеабилизируйте нейроны 0,3% неионогенного поверхностно-активного вещества в PBS 1x в течение 5 мин при ЛТ.
4. Коротко вымыть PBS 1x, 3 раза.
5. Инкубируйте нейроны с 3% фетальной сывороткой крупного рогатого скота (FBS) в PBS 1x в течение 30 минут в режиме РТ для блокирования неспецифических сайтов связывания на орбитальном шейкере.
6. Инкубировать нейроны с соответствующими первичными антителами, растворенными в 3% FBS в PBS 1x, O/N при 4 °C на орбитальном шейкере.
   Примечание: использовали антитела syn303 (1:1000), мышиного αS (1:200), pser129-αS (1:1000) и Tau (1:1000).
7. Удалите раствор антитела и кратковременно смойте PBS 1x, 3 раза.
8. Инкубируйте нейроны с соответствующими флуоресцентными вторичными антителами, растворенными в 3% FBS в PBS в течение 1 ч при ЛТ в темноте на орбитальном шейкере.
9. Удалите раствор антитела и кратковременно смойте PBS 1x, 3 раза.
10. Окрашивание нейронов раствором DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) (0,1 мкг/мл в PBS 1x) в течение 15 мин при ЛТ в темноте на орбитальном шейкере.
11. Удалите раствор антитела и кратковременно смойте PBS 1x, 3 раза.
12. Закрепите покровные стекла на слайде с помощью монтажной среды, предотвращающей выцветание.

Результаты

Рисунок 1. Культуры корковых нейронов. Репрезентативное изображение, показывающее плотность культур корковых нейронов в DIV 7. Изображения были получены с помощью микроскопа с инвертированным светом и объективом 10X. Масштабная линейка = 100 мкм.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
сахароза	Сигма-Олдрич	84097-1КГ
Хепес	Сигма-Олдрич	H0887-100МЛ	1М рН=7-7,6
Эдта	Сигма-Олдрич	0390-100мл	рН=8 0,5 М
Хлорид магния	Сигма-Олдрич	М8266-100Г
углекислый натрий	Сигма-Олдрич	С7795-500Г
Бикарбонат натрия	Сигма-Олдрич	С5761-500Г
метанол	Сигма-Олдрич	322415-6X1L
KCl	Сигма-Олдрич	П9541-500Г
cOmplete Mini	Рош	11836170001	ингибитор протеазы
ФосСтоп	Рош	4906837001	Ингибитор фосфатазы
Набор для анализа белка BCA	Евроклон	EMPO14500
Criterion TGX 4-20% без пятен, 18 лунок	Биорад	5678094
Поддерживаемая нитроцеллюлозная мембрана	Биорад	1620097	0,2 мкм
Блокатор блоттингового класса	Биорад	1706404	Обезжиренное сухое молоко
Хемилюминесцентная подложка SuperSignal West Pico	Термо Фишер Научный	No 34077 (Английский
азотная кислота	Сигма-Олдрич	1004411000	65%
Стеклянные покровные стекла	Термо Фишер Научный	1014355118НР1	18 мм х
Поли-D-лизин	Сигма-Олдрич	П7280
Сбалансированный солевой раствор Хэнка	Термо Фишер Научный	14170-500 мл
Пенициллин/стрептомицин	Термо Фишер Научный	15140122	10 000 Ед/мл, 100 мл
Модифицированный Eagle's Medium от Dulbecco	Термо Фишер Научный	D5796-500 мл
Трипсин-ЭДТА	Термо Фишер Научный	15400054	0,50%
Дополнение B27	Термо Фишер Научный	17504044	В 50 раз
Глутамакс	Термо Фишер Научный	35050-038 (Английский)	в 100 раз
ДНКаза	Сигма-Олдрич	Д5025
Фетальная бычья сыворотка	Евроклон	EC50182L
глутамат	Сигма-Олдрич	1446600-1Г
Гентамицин	Термо Фишер Научный	15710	10 мг/мл
Нейробазальная среда	Термо Фишер Научный	10888-022
Цитозин арабинозид (AraC)	Сигма-Олдрич	C3350000
Монтажная среда VECTASHIELD с защитой от выцветания	Лаборатория «Вектор	Н-1000
DAPI	Термо Фишер Научный	No 62247
Ротор 90 Ti	Бэкмен	Н/Д	Ротор ультрацентрифуги
Ультрацентрифуга Optima L-90K	Бэкмен	Н/Д
Антитело Syn-1, клон 42	BD Biosciences	610786	Баланс белой зоны защиты от мыши: 1:5000
Антитело к Syn303	Биолегенда	824301	антимышь ЕСЛИ: 1:1000
Антитела к тау	Синаптические системы	314 002	антикроличья ПЧ: 1:10 000
Антитело pser129-αS	Подарок от Фудзивара и др., ссылка 19		Противозаячья ВБ: 1:5000
Антитело pser129-αS	Абкам	АБ51253	антикроличий ЕСЛИ: 1:1000
Мышь αS (D37A6) XP	Клеточная сигнализация	No 4179	антикроличий ПЧ 1:200
Alexa fluor 555-конъюгированное антитело против кролика	Термо Фишер Научный	А27039
Alexa fluor 488-конъюгированное антитело против мыши	Термо Фишер Научный	А-11029
Микросон XL-2000	Мисоникс		Ультразвуковой аппарат
Ultra Bottles (Oakridge Bottles), печатная плата, 16x76 мм, сборка, крышка Noryl, тип Beckman	Научная служба ЕС	С4484	Ультрацентрифужные пробирки
Микроскоп инвертированного света AXIO Observer	Цейсс	Н/Д
Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп TCS SP2	Лейка	Н/Д
Инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп	Компания Nikon	Н/Д
Тритон х-100	Сигма-Олдрич	Х100-500МЛ	Неионогенное поверхностно-активное вещество

) »