Модель in vitro повреждения растяжения в индуцированных плюрипотентными стволовыми клетками нейронах человека

Аннотация

Источник: Phillips, J. K. et al. Метод высокоскоростного растяжения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток нейронов человека в формате 96 лунок. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео демонстрируется процесс индуцирования растяжения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток нейронов человека (hiPSCN). Клетки отбираются в бездонную многолуночную пластину с прикрепленной силиконовой мембраной. Контролируемое механическое напряжение прикладывается к мембране, чтобы вызвать нарушение цитоскелета и повреждение клеточной мембраны, вызывая фенотип растяжения в клетках.

Протокол

1. Изготовление пластин

1. Плазменную обработку 96-луночной пластины плазменным очистителем мощностью 200 Вт (см. Таблицу материалов) в течение 60 с на высокой мощности, поместив ее нижней стороной вверх внутрь плазменного очистителя. Проверьте, не видно ли через окошко камеры фиолетового свечения, которое говорит о том, что образовалась эффективная плазма. Эта техника склеивания заимствована у Sunkara et al.
2. В течение 60 с поместите верхнюю часть планшета в 200 мл 1,5% (3-аминопропил) триэтоксисилана (APTES) в деионизированную (DI) воду на 20 минут нижней стороной вниз. Этот раствор нестабилен: готовьте его не более чем за 60 с до введения пластины.
   осторожность: Работа с APTES в вытяжном шкафу.
3. Плазма обрабатывает экстрагированную силиконовую мембрану в плазмочистителе в течение 60 с на большой мощности. Рассчитывайте время обработки плазмой таким образом, чтобы она закончилась не более чем за 5 минут до окончания 20-минутного периода на шаге 1.2.
4. С помощью щипцов расположите обработанную плазматией мембрану поверх прямоугольника из пергаментной бумаги размером 7,5 x 11 см² дюйма. Совместите алюминиевую плиту размером 7,5 см x 11 см x 0,5 см с нижней частью зажима для изготовления плиты. Совместите силиконовую мембрану и пергаментную бумагу на алюминиевой плите с помощью щипцов.
5. Выньте крышки тарелок из ванны APTES и стряхните излишки раствора. Опустите в водяную баню объемом 200 мл DI на 5 с и стряхните лишнюю воду. Опустите в другую водяную баню объемом 200 мл DI на 5 секунд и стряхните лишнюю воду. Замените воду в этих ваннах перед тем, как окунуть еще одну тарелку сверху.
6. Используйте сжатый воздух для полного высыхания верхней части пластины.
7. Поместите верхнюю часть пластины в верхнюю часть зажима для изготовления пластины. Аккуратно закройте зажим для изготовления пластины, чтобы прижать верхнюю часть пластины и силикон вместе. Зажим не менее 1 ч.
8. Перед использованием дайте пластине затвердеть в течение 24 часов при комнатной температуре в защищенном от пыли месте.

2. Растягивание тарелки

1. Очистка инденторов
   1. Приготовьте ультразвуковой аппарат мощностью 60 Вт для ванны с деионизированной водой комнатной температуры.
   2. Поддержите блок инденторов над ванной с ультразвуковой канцелярией, перевернутый так, чтобы только верхние части инденторов были погружены на глубину не менее 1 мм. Обрабатывайте инденторы ультразвуком в течение 8 мин при частоте 42 кГц.
   3. Высушите инденторы сжатым воздухом.
2. Выравнивание блока инденторов
   1. Расположите камеру с прямой трансляцией над устройством растяжения так, чтобы она смотрела вниз на массив инденторов. Сосредоточьтесь на верхних частях отступов.
      заметка: Конфигурация, описанная в разделе 3, «Определение растяжения мембраны», является одной из возможных настроек камеры для этой задачи.
   2. Закрепите пластину на ступице устройства для нанесения травмы с помощью зажимов для предмета (рис. 1) и поместите над ><устройством купольный светильник. заметка: Смотрите Таблицу материалов для программного обеспечения для управления прибором.
   3. Запустите программное обеспечение для управления прибором, щелкнув значок программного обеспечения на рабочем столе компьютера, на котором управляется устройство для управления травмой. Запустите проект "in_vitro_neurotrauma.lvproj", кликнув по нему в окне запуска. Из окна проекта запустите виртуальные инструменты управления движением и отслеживания положения (ВИ), которые называются «motion_control.vi» и «position_tracker.vi» соответственно, дважды кликнув по ним.
   4. Закройте клетку, окружающую устройство для травмы. Нажмите кнопку со стрелкой в верхнем левом углу VI управления движением, чтобы запустить VI, и нажмите «Near Bottom», чтобы опустить столик на расстояние 2 мм от контакта с отступами. Нажмите кнопку «Стоп», чтобы остановить VI.
      осторожность: Держите руки подальше от носилок при работе с камерой в клетке. Клетка должна быть оснащена дверным выключателем, который подает питание на растягивающее устройство только при закрытой дверце клетки.
   5. В окне проекта щелкните правой кнопкой мыши по «Оси 1». Нажмите на «Интерактивная тестовая панель». В открывшемся окне установите размер шага равным 50 μм, введя в поле «Целевая позиция» «500 единиц».
   6. Нажимайте зеленую кнопку «Перейти» в нижней части окна «Интерактивная тестовая панель» несколько раз, пока пластина не соприкоснется с отступами. Проверьте наличие контакта на изображении в реальном времени, отображаемом камерой. Обратите внимание на вертикальное положение рабочей области, указанное в верхнем левом углу окна «Интерактивная тестовая панель»; Это положение первого контакта.
   7. Опускайте далее (как описано в шаге 2.2.6) до тех пор, пока каждая лунка не войдет в контакт с инденторами. При необходимости переместите камеру, чтобы увидеть всю пластину, и переместите столик вверх (указав отрицательную «Целевую позицию») и вниз. Обратите внимание на вертикальное положение сцены, указанное в верхнем левом углу окна, когда все стойки находятся в контакте (это полное положение контакта).
   8. Обратите внимание на разницу между положением первого контакта и положения полного контакта. Закройте «Интерактивную тестовую панель». Запустите 'motion control VI' (см. шаг 2.2.4) и нажмите 'Top', чтобы поднять сцену. Остановите управление движением VI кнопкой «Стоп».
   9. Как только уровень окажется на вершине своего движения, откройте дверь, чтобы деактивировать устройство. Отрегулируйте установочные винты по углам блока инденторов. Ослабьте установочный винт на углу, который соприкоснулся первым, чтобы опустить его и затяните противоположный винт, чтобы поднять угол, который соприкоснулся последним.
   10. Повторяем процесс опускания предметного столика до тех пор, пока пластина не соприкоснется с инденторами, осмотра контактных изображений на предмет наклона, подъема предметного столика и регулировки (шаг 2.2.9) блока индентора. Когда сцена и блок выровнены, все инденторы соприкоснутся одновременно.
   11. Откройте дверцу, чтобы деактивировать устройство. Вставьте крепежные винты в отверстия на блоке инденторов и затяните их. Убедитесь, что блок находится на одном уровне с установленными крепежными винтами (шаги 2.2.4-2.2.8). Обратите внимание на положение сцены, которое сообщает «Интерактивная тестовая панель», когда пластина соприкасается. Это будет нулевая позиция для экспериментов с индентированием.
3. Смажьте инденторы
   1. Если блок инденторов только что был установлен и еще не был смазан, очистите твердую резиновую прокладку (7,5 см x 11 см x 1,5 мм) и мягкую поролоновую прокладку с закрытыми порами (7,5 см x 11 см x 3 мм) лабораторной салфеткой, пропитанной этанолом. Дайте им высохнуть на воздухе.
   2. Смочите лабораторную салфетку в кукурузном масле и распределите ее по твердой резиновой губке до тусклого блеска.
   3. Поместите поролоновую губку на твердую резиновую губку, чтобы масло перелилось на поролоновую подушку. Поместите алюминиевую плиту размером 7,5 см x 11 см x 0,5 см поверх поролоновой подушки и загрузите ее балластным грузом весом около 360 г (например, 6 конических трубок, загруженных 45 мл воды каждая), чтобы обеспечить равномерный перенос масла с твердой резиновой прокладки на поролоновую подушку. Подождите 10 секунд, чтобы масло перелилось на поролоновую подушечку.
   4. Переместите поролоновую прокладку на массив инденторов. Поместите алюминиевую плиту и балластный груз поверх нее, чтобы обеспечить равномерный перенос масла к наконечникам отступников. Подождите 10 секунд, чтобы масло перешло к отступникам.
   5. Если с момента первой установки и смазки инденторного блока пластина не была растянута, растяните тестовую пластину перед началом эксперимента. Примечание: Это предотвратит путаницу в эксперименте из-за несоответствий между первым и последующими участками. Для последующих растяжек повторяйте только шаги 2.3.2-2.3.5 перед каждым растяжением.
4. Растягиваем тарелку
   1. Смажьте инденторы, как описано в шаге 2.3.
   2. Закрепите пластину на ступени устройства травмы с помощью зажимов для ступеней. Если требуется стерильность, отрегулируйте положение крышки, чтобы зафиксировать пластину, не подвергая поверхность культуры воздействию воздуха в помещении.
   3. Опустите столик в нулевое положение с помощью «управления движением VI» (см. шаги 2.2.4-2.2.6); нулевое положение определяется на шаге 2.2.
   4. Измените имя файла в поле «путь к файлу» в «VI отслеживания позиции» на уникальное имя файла, а затем запустите его с помощью кнопки «стрелка» в верхнем левом углу этого окна.
   5. Установите глубину и продолжительность отступа (обычно 1-4 мм и 30 мс соответственно, максимальная глубина 5 мм, минимальная продолжительность 15 мс) в полях «Травма (мм)» и «Продолжительность травмы (мс)» в «Панели управления движением VI», кликнув по полям и введя нужные значения.
   6. Запустите «Панель управления движением VI» и нажмите «Травмировать», чтобы сделать отступ на пластине.
   7. Переместите арену вверх по вершине ее хода, нажав на кнопку "Top". Затем остановите VI кнопкой «Стоп» и отключите устройство травмирования, открыв дверь.
   8. Проверьте историю смещения ступени, представленной в «Системе отслеживания положения VI», чтобы убедиться, что было применено указанное максимальное смещение. Щелкните правой кнопкой мыши по графику и нажмите «Экспорт в Excel». Нажмите на «Файл| Сохранить», чтобы сохранить данные.

3. Определение характеристик растяжения мембраны

1. Покрасьте углубление в верхней части каждого индентора в белый цвет, чтобы обеспечить высококонтрастный фон для высокоскоростной видеосъемки. Внимание: Не красьте диски инденторов в местах, где они соприкасаются с пластинами.
2. 3D-печать с использованием полимолочной кислоты (PLA) или иным образом изготовить цилиндрический штамп, с помощью которого сделать точку в каждой лунке. Сделайте цилиндр диаметром 5,9 мм и высотой 12,2 мм, с цилиндрическим выступом диаметром 1,5 мм и высотой 1,0 мм по центру сверху.
3. Плазма обрабатывает планшет правой стороной вверх для активации поверхности силиконовой клеточной культуры в лунках в течение 60 с, как указано в шаге 2.1.
4. Положите пластину на резиновую подушку или другую мягкую поверхность. Загрунтуйте небольшой выступ на штампе (см. шаг 1.2) чернилами перманентного маркера. Вставьте штамп в тестируемую лунку и постукивайте, чтобы убедиться в хорошем переносе чернил. Штамп загрунтуйте перед каждым колодцем.
5. Выровняйте блок инденторов и смажьте инденторы травматического устройства (см. шаги 2.2-2.3). Зажмите пластину на ступени устройства травмы. Расположите яркий рассеянный осевой свет над устройством для получения травмы.
6. Установите высокоскоростную камеру на стойке стрелы над устройством для травм, направленной прямо вниз, с объективом, установленным на наименьшую пронумерованную диафрагму, и включите ее. Запустите программное обеспечение камеры на компьютере, подключенном к камере. В раскрывающемся меню частоты кадров выберите 2 000 кадров в секунду, а в раскрывающемся меню затвора выберите самое быстрое время экспозиции, которое дает высококонтрастные изображения. Центр над пунктирными колодцами.
   1. Расположите камеру так, чтобы в поле зрения было 12 лунок в сетке 3 x 4.
      заметка: Такое поле зрения обеспечивает оптимальный компромисс между пропускной способностью и разрешением для изображения размером 1 280 × 1 024.
7. Опустите пластину до нулевой точки (см. шаги 2.2.4-2.2.6). Нажмите кнопку записи в программном обеспечении камеры, чтобы она прочитала «триггер». Инициируем трекер позиции VI (шаг 2.4.4).
8. Включите яркий рассеянный осевой свет. Сделайте отступ на пластине, как описано в шаге 2.4.6.
9. Выключите яркий рассеянный осевой свет.
10. На компьютере управления камерой найдите окно записи продолжительностью 30–40 мс, в котором происходит отступ: перетащите стрелки начала и конца на полосе воспроизведения высокоскоростного видео в программном обеспечении камеры. Нажмите «Сохранить», укажите имя в поле «Имя файла», выберите «TIFF» в поле «Формат» и нажмите «Сохранить».
    1. Просмотрите файл . TIF-файлы для изображений наименее растянутых (начальное) и наиболее растянутых (пиковый отступ) состояний.
    2. Чтобы измерить высоту и ширину точек на обоих изображениях, используйте Фиджи, чтобы открыть изображения наименьшей и максимальной растяжки рядом. Используя стандартный инструмент прямоугольного выделения, щелкните и перетащите, чтобы нарисовать рамку вокруг точки на изображении с наименьшей растяжкой. Измерьте высоту и ширину с помощью функции «Анализ| Измеряй».
    3. Повторите то же самое для точки в той же лунке на изображении растяжения пика. Повторите для остальных лунок.
11. Рассчитайте деформацию Лагранжа в направлениях x и y следующим образом:
    
    заметка: Здесь E_xx — деформация Лагранжа в направлении x, E_yy — деформация Лагранжа в направлении y, X — ширина точки, Y — высота точки, _f обозначает конечное изображение (т. е. изображение пикового отступа), а _i обозначает исходное изображение (т. е. изображение до индентирования). Усредните два значения, чтобы определить деформацию в этой скважине.

4. Покрытие культивируемых клеток

1. Автоклавируйте бункеры и балластные грузы, которые будут использоваться для стерилизации.
2. Плазмой обрабатывайте пластины с силиконовым дном правой стороной вверх в течение 60 с (см. шаг 1.1). Немедленно погрузите пластины в стерильные контейнеры, содержащие 70% этанола, на 15 минут.
3. Погрузите планшеты в стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS) в отдельные стерильные бункеры на 30 минут.
4. Отсасывайте PBS из лунок. Сушите только одну пластину за раз, чтобы предотвратить потерю плазменной обработки в лунках.
   осторожность: Пластины с силиконовым дном обеспечивают меньшую тактильную обратную связь, чем жесткие пластины, при пипетировании и с большей вероятностью блокируют кончик пипетки.
5. Добавьте в стерилизованные тарелки 100 мкл 0,1 мг/мл поли-L-орнитина (PLO) на лунку. Выдерживать при комнатной температуре в течение 1 ч.
6. Дважды промойте лунки 100 мкл стерильным PBS, оставив вторую промывку на лунках до готовности клеточной суспензии.
7. Извлеките флакон с hiPSCN из хранилища жидкого азота в защитных перчатках и положите на сухой лед. Быстро перенесите флакон на водяную баню при температуре 37 °C и размораживайте ровно 3 минуты. Не переворачивайте флакон.
8. В стерильном колпаке аккуратно переложите содержимое флакона в коническую пробирку объемом 50 мл с помощью серологической пипетки объемом 1 мл.
9. Промойте пустой криогенный флакон 1 мл среды для полного обслуживания комнатной температуры (основа среды + добавка).
10. Переливайте 1 мл среды в пробирку объемом 50 мл по каплям примерно по одной капле в секунду. Аккуратно поворачивайте тюбик во время добавления. Добавьте 8 мл среды комнатной температуры в пробирку объемом 50 мл со скоростью около 2 капель/с.
11. Закройте трубку крышкой и переверните 2-3 раза. Посчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Рассчитайте объем дополнительной среды, необходимой для разбавления клеточной суспензии до 225 000 клеток/мл.
Осторожно нанесите
12. количество среды (рассчитанное выше) в пробирку с клеточной суспензией с помощью серологической пипетки объемом 25 мл.
13. Добавьте 10 мкл запаса ламинина 1 мг/мл на 1 мл клеточной суспензии с помощью микропипетки объемом 1000 мкл, чтобы получить 10 мкг/мл ламинина в клеточной суспензии. Отсасывайте вверх и вниз по одному разу с наконечником, используемым для ламинина, затем закройте трубку крышкой и переверните трубку один раз.
14. Отсасывайте PBS из планшетов, по одной пластине за раз. С помощью многоканальной пипетки добавьте 100 мкл клеточной суспензии hiPSCN в каждую лунку. Лунки имеют площадь культивирования 0,33^см2, поэтому плотность клеток на площадь составляет 67 500 клеток/^см2.
15. Оставьте пластины при комнатной температуре на 15 минут после посева, чтобы облегчить прикрепление. Чтобы избежать вибраций вентилятора стерильного вытяжного шкафа, поместите закрытые пластины на лабораторный стол. Инкубируйте культуры при 37 °C с 5%_CO2.
16. Выполните полную замену фильтрующего материала в 24 часа, повторно заполнив лунки 200 μл полного технического фильтрующего материала. Выполняйте половинную замену среды в объеме 100 мкл каждые 2-3 дня.

5. Нанесение вреда культурам

1. Выровняйте блок индентора и найдите нулевое положение, как описано в шаге 2.2. Смажьте инденторы, как описано в шаге 2.3.
2. Установите имя файла для истории перемещений в «Трекер положения VI» (шаг 2.4.4). Установите параметры травмы в 'motion control VI' (шаг 2.4.5).
3. Достаньте пластину, которую нужно травмировать, из инкубатора и закрепите ее на сцене. Отрегулируйте положение крышки, чтобы закрепить пластину, не подвергая культуры воздействию воздуха в помещении.
4. Опустите пластину до нулевой точки (шаги 2.2.4-2.2.6) с помощью «управления движением VI». Запустите «Трекер позиций VI» (шаг 2.4.4).
5. Используйте рычаг управления движением VI для вдавливания пластины (как описано в шаге 2.4.6). Для фиктивных растяжек пропустите только этот шаг.
6. Верните рабочую область в верхнюю точку диапазона движения (см. шаг 2.4.7). Верните тарелку в инкубатор.
7. Осмотрите и сохраните след смещения (как в шаге 2.4.8).

Результаты

Рисунок 1: Маркированная схема устройства для нанесения травмы. (A) вид сверху, (B) изометрический вид, (C) вид спереди, (D) вид справа. Масштабная линейка применяется к ортогональным видам (A, B и D).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
.010" Силиконовый лист	Специализированное производство, Inc	#70P001200010	Лист полидиметилсилоксана (PDMS)
Спарклин	Научный Фишер	#043204
Nunc 256665	Научный Фишер	#12-565-600	Бездонная 96-луночная пластина
Салфетки Ким	УЛИН	С-8115
Плазменный очиститель	Гаррик Плазма	#PDC-001-HC
(3-аминопропил) триэтоксисилан	Сигма-Олдрич	#440140	АПТЕС
Пергаментная бумага	Рейнольдс	Н/Д
Купольный свет	CCS inc	LFX2-100SW
Источник питания купольного света	CCS inc	ПСБ-1024ВБ
Осевой диффузный осветительный прибор	Сименс	Nerlite DOAL-75-LED	Рассеянный осевой свет
Мощная светодиодная матрица	CREE	XLamp CXA2540	Мощная светодиодная матрица
Держатель для светодиодов	Molex	1807200001	Держатель светодиода
Блок питания светодиодов	Добрый смысл	HLG-320H-36B	Источник питания постоянного тока
Программа для просмотра FastCam	Фотрон		Программное обеспечение камеры
Fastcam Mini UX50	Фотрон	Н/Д	Высокоскоростная камера
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8	Никон	#1455	Высокоскоростной объектив камеры
0,1 мг/мл поли-L-орнитина	Сигма-Олдрич	#P4597
iCells	Клеточная динамика Интернэшнл	#NRC-100-010-001
iCell media	Клеточная динамика Интернэшнл	#NRM-100-121-001
Добавка iCell	Клеточная динамика Интернэшнл	#NRM-100-031-001
Ламинин	Сигма-Олдрич	#L2020
привод звуковой катушки	БЭЙ Кимко	ЛА43-67-000А
оптический линейный энкодер	Компания Renishaw	Т1031-30А
Сервопривод	Управление Копли	Xenus XTL
Контроллер	Национальные инструменты	cRIO 9024 Контроллер PowerPC в реальном времени
cRIO шасси	Национальные инструменты	cRIO 9113
модуль цифрового ввода	Национальные инструменты	NI 9411
Шасси для сбора данных	Национальные инструменты	NI 9113
LabVIEW	Национальные инструменты
hiPSCNs	Клеточная динамика Интернэшнл