$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Животные
- Поддерживайте штамм TgBAC (gfap:gfap-GFP) данио-рерио 167 (AB) в возрасте от 6 до 9 месяцев в стандартных условиях в воде с температурой 26,5 °C и 14/10 часовым циклом свет/темнота.
2. Обратимая системная анестезия
- Приготовьте стоковый раствор этил3-аминобензоата метасульфоната соли (трикаина) путем растворения 400 мг порошка трикаина в 97,9 мл воды в резервуаре и 2,1 мл 1 М трис-буферизованного физиологического раствора (ТБС). Отрегулируйте pH до 7,0 с помощью 1 M Tris (pH 9) и храните при температуре 4 °C в темноте до одного месяца><.
заметка: Трикаин следует готовить в воде так, как это предусмотрено в естественных условиях обитания животного, желательно использовать оригинальную воду из бака.
- Разведите стоковый раствор до 1:25 в воде бака и используйте немедленно.
- Поместите рыбок данио в чашку Петри диаметром 10 см, содержащую 50 мл раствора для анестезии, пока они не станут неподвижными и не перестанут реагировать на внешние раздражители (примерно 2 - 5 минут, в зависимости от веса и возраста).
- Перенесите каждую рыбу вручную в изготовленный на заказ силиконовый держатель для лазерного лечения (рис. 1A).
осторожность! Рыбы могут оставаться под наркозом вне аквариума только до 10 минут.
- Чтобы отменить анестезию после лечения и/или визуализации, поместите рыбок данио в контейнер с водой в аквариуме.
- Чтобы ускорить восстановление, создайте поток пресной воды из аквариума над жабрами, перемещая рыбок данио взад и вперед в воде.
3. Лазерное фокальное повреждение сетчатки
ПРИМЕЧАНИЕ: Диодный лазер с длиной волны 532 нм используется для создания фокусного светового повреждения на сетчатке данио. Экспериментальная установка лазера позволяет установить воспроизводимое очаговое повреждение сетчатки у взрослых рыбок данио.
- Настройка выходной мощности лазера: 70 мВт; диаметр антенны: 50 мкм; длительность импульса: 100 мс.<бр/>
осторожность! Использование лазерного излучения требует соответствующей индивидуальной защиты и маркировки территории.
- Нанесите 1 - 2 капли 2% гидроксипропилметилцеллюлозы местно в глаз перед лечением и используйте лазерную линзу 2,0 мм для фокусировки лазерного луча на сетчатке><.
осторожность! Капли гидроксипропилметилцеллюлозы вязкие и могут вызвать проблемы с дыханием, если она попадает на жабры.
- Поместите четыре лазерные точки вокруг зрительного нерва на левом глазу и используйте правый, необработанный глаз в качестве внутреннего контроля.
