Измерение активации рецепторов запаха с помощью циклического анализа аденозинмонофосфата в реальном времени

Аннотация

Источник: Zhang, Y. et al., Измерение активации рецептора запаха живыми клетками с использованием анализа cAMP в реальном времени. J. Vis. Exp.(2017)

Это видео демонстрирует протокол измерения активации рецептора запаха в трансфицированных клетках с использованием биосенсора циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) и обнаружения люминесценции. Метод применяется для изучения рецептор-лигандных взаимодействий и сигнальных путей в обонятельных нейронах.

Протокол

1. Стимуляция и измерение активности рецепторов запаха (ОШ) с помощью анализа cAMP в реальном времени

1. Наблюдайте за трансфицированными клетками под фазово-контрастным микроскопом, чтобы убедиться в правильном слиянии 50-80% на лунку и возвращении в инкубатор.
2. Приготовьте среду для стимуляции, добавив 10 мМ гидроксиэтилпиперазитансульфоновой кислоты (HEPES) и 5 мМ глюкозы в сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS).
3. Разморозьте аликвоты субстрата анализа цАМФ в режиме реального времени на льду. Реагент на основе субстрата хранить при температуре -80 °C по 55 мкл на пробирку в пробирках полимеразной цепной реакции (ПЦР). Используйте по 1 тюбику на тарелку.
4. Приготовьте 2% уравновешивающий раствор, смешав 55 мкл реагента для субстрата и 2750 мкл раствора HBSS/HHEPES/глюкозы.
5. Расстелите на скамейке толстый слой бумажных полотенец. Аккуратно и многократно постучите тарелку вверх дном по бумажному полотенцу, чтобы среда для переливания полностью впиталась в него.
6. Промойте клетки, пипетируя 50 μл раствора HBSS/HEPES/глюкозы в каждую лунку.
7. Аккуратно и многократно вытряхните раствор HBSS/HEPES/глюкозы из 96-луночного планшета.
8. Пипеткой внесите 25 мкл 2% уравновешивающего раствора в каждую лунку и инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 2 ч.
9. Заранее приготовьте 1 М раствор одоранта в диметилсульфоксиде (ДМСО) и храните при температуре -20 °C до использования.
10. До окончания времени инкубации разбавьте исходные растворы одоранта до рабочих концентраций в среде для стимуляции HBSS/HEPES/глюкозы.
    заметка: Концентрации разбавлений одорантов, приготовленных на этом этапе, должны быть удвоены для получения правильных конечных концентраций в каждой лунке.
11. С помощью считывателя хемилюминесцентных планшетов перед добавлением одоранта измерьте уровень базальной люминесценции планшета 2 раза подряд со скоростью 1000 мс на лунку.
12. Быстро извлеките пластину из считывателя планшетов, добавьте в каждую лунку 25 μL разбавлений одоранта и немедленно начните непрерывное измерение люминесценции всех лунок в течение 20 циклов в течение 30 мин.<бр/> заметка: Делайте пипетку осторожно, чтобы не загрязнить соседние лунки при использовании разных одорантов и/или разных концентраций одних и тех же одорантов в одной и той же пластине.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Дмсо	сигма	Д2650
Реагент GloSensor cAMP	Компания Promega	Е1290
ГБСС, без хлорида кальция и хлорида магния	GIBCO	14175095
ХЕПЕС	Гиклон	SH30237
Мускон	Санта-Крус	СК-200528
Мускусный тибетский	Сигма-Олдрич	S359165
PBS, без кальция или магния	Селлгро	21-040-ЧВ
ПЦР-пробирка 0,2 мл	Аксиген	ПЦР-02-С
Пробирка Eppendorf объемом 1,5 мл	Эппендорф
Коническая трубка 15 мл 17 мм x 120 мм	BD Falcon	352096
8-луночный и/или 12-луночный многоканальный пипетец	Эппендорф
96-луночный планшет для культуры лейкоцитов с плоским дном	Грейнер	655098
Чашка для клеточных культур 100 мм x 20 мм	BD Falcon	353003
Считыватель пластин Infinite F200	Текан