Характеристика внеклеточного пространства в срезе мозга с помощью ионоселективных микроэлектродов и микроэлектродов ионофореза

Abstract

Источник: Odackal, J., et al. Ионофорез в реальном времени с тетраметиламмонием для количественной оценки объемной доли и извитости внеклеточного пространства мозга. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует, как охарактеризовать внеклеточное пространство в срезе мозга с помощью микроэлектродов ионоселективного и ионофореза для измерения и сравнения электрических сигналов. Этот процесс помогает определить объемную долю пространства и степень скручивания.

Protocol

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Ионофорез в реальном времени в срезах мозга

1. Поместите срез мозга толщиной 400 мкм в записывающую камеру, убедившись, что он полностью погружен в текущую искусственную спинномозговую жидкость (ACSF). Расположите срез с помощью акварельной кисти и аккуратно закрепите его сеткой.
2. Переместите микроэлектрод ионофореза и ISM над областью интереса на срезе мозга. Погрузите оба в проточную АКСУ, но выше среза.
3. Смещение напряжения для опорного и ионного каналов на значение «0» мВ. Дождитесь стабилизации напряжения в обоих каналах. На самописце отметьте напряжение, измеренное на ионном чувствительном канале ISM. Используйте его для вычисления базового параметра V в Wanda.
4. Поместите микроэлектрод ISM и ионофореза на глубину 200 мкм в срез и на расстоянии 120 мкм друг от друга. Дождитесь стабилизации сигнала после перемещения микроэлектрода в срез мозга.
   заметка: Ток смещения, приложенный к микроэлектроду ионофореза, вызывает небольшое накопление тетраметиламмония (ТМА). Распространенной ошибкой является слишком ранняя запись и недооценка нарастания сигнала.
5. Отметьте на самописце стабилизированное напряжение, измеренное в срезе мозга на ионочувствительном канале ISM. Рассчитайте разность напряжений между сигналом TMA, измеренным на шаге 8.3 и шаге 8.4, и введите это значение в поле «Базовая линия V (мВ)» в поле «Измерительный электрод» графического пользовательского интерфейса Wanda.
6. В левой части графического интерфейса убедитесь, что все экспериментальные параметры правильно записаны/введены. Установите "Среда" на "Мозг", "Транспортное число" на среднее значение, рассчитанное для микроэлектрода ионофореза на шаге 7.4, а "Температура" на температуру ванны, в которой находится срез.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Значение V должно быть зарегистрировано для каждого набора измерений. Базовая линия V будет преобразована Вандой в исходный параметр C (mM) (т.е. концентрацию ТМА в тканях мозга).
7. Запустите запись, нажав «Получить», и дайте ей сделать полную запись. Подождите, пока сигнал TMA вернется к исходному уровню, прежде чем получать новую запись.
8. Сделайте две-три последовательные записи, прежде чем удалять микроэлектроды из выбранного места мозга. Вводите измеренную температуру в программное обеспечение Wanda непосредственно перед каждой записью.
9. Переместите оба микроэлектрода по диагонали обратно к поверхности среза. Поднимите оба на высоту не менее 50 мкм над срезом. С помощью самоуказателя определите любое изменение между значением V, измеренным в данный момент, и его измерением, начиная с шага 8.3.
10. Центрировать кончики ISM и ионтофоретических микроэлектродов относительно друг друга по осям x, y и z. Получите информацию об изменениях расстояния, если таковые имеются, с дисплея блока управления микроманипулятором.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
усилитель для ISM	Даган	Модель IX2-700 Двойной внутриклеточный предусилитель	усилитель ионного и опорного напряжения с головными каскадами N=0.1 (для опорного цилиндра) и N=0.001 (для ионного цилиндра)
Мискроскоп биологического соединения (с объективом 4x и 10x)			для сколов наконечников микроэлектродов и контроля микроэлектродов; различные поставщики, например, AmScope
Боросиликатная тетакапиллярная стеклянная трубка	Гарвардский аппарат	Warner Instruments модель TG200-4; заказ #64-0811	трубка стеклянная двуствольная для ионоселективных микроэлектродов и ионтофоретических микроэлектродов; наружный диаметр 2,0 мм, внутренний диаметр 1,4 мм, перегородка 0,2 мм, длина 10 см
самописец			непрерывно регистрировать напряжение на ионоселективном микроэлектроде во время калибровки в стандартах тетраметиламмония и во время эксперимента RTI; например, двухканнельная диаграмма Kipp & Zonen типа BD112 записана, доступна восстановленная
Коммерческое программное обеспечение	Математические работы	MATLAB, Набор инструментов для сбора данных	для сбора и анализа данных с помощью программ Wanda и Walter. Обратите внимание, что доступна академическая лицензия.
Защитные очки для глаз	рыбак
Стационарный составной микроскоп	Олимп	BX51WI	Можно использовать другие составные микроскопы с фиксированными столиками
щипцы	Инструменты для точной науки	#11251-10	к сколам стеклянного капилляра; Dumond #5, предпочтительно б/у и больше не нужен для тонкой работы
ионофоретическая единица	Даган	ИОН-100 и ПС-100	ИОН-100 представляет собой одноканальный блок ионофореза +/- 130 В; PS-100 – внешний источник питания; альтернативы: например, Axoprobe-1A производства Axon Instruments (теперь Molecular Devices), снят с производства, проверьте наличие восстановленных устройств (eBay и другие сайты)
Держатель микроэлектродов	ВПИ	M3301EH	удерживать ионоселективный микроэлектродный сборный для силанизации и заполнения наконечника ионоселективного цилиндра жидким ионитом; WPI продает две версии этого держателя: прозрачную M3301EH и черную M3301EH. По нашему опыту, прозрачная M3301EH кажется более прочной, чем черная M3301EH.
микроманипулятор	Нарисигэ	ММ-3	Для позиционирования предварительно изготовленного ионоселективного микроэлектрода при силанизации и заполнении наконечника ионоселективного цилиндра жидким ионитом; может быть заменен любым трехосевым микроманипулятором в хорошем рабочем состоянии
Цель 5x Сухая	Олимп	MPlan N
Цель 10x погружение в воду	Олимп	UMPlan FL N	10-кратный объектив - погружение в воду, числовая апертура - 0,3, рабочее расстояние - 3,3 мм
Платформа и X-Y трансляционный столик для микроскопа с неподвижным столиком	EXFO	Гибралтар Берли	Платформа вмещает срезовую камеру, микроманипуляторы и аксессуары, поступательный столик X-Y перемещает микроскоп без ущерба для стабильности записи
Роботизированный микроманипулятор с точным позиционированием по осям X, Y, Z	Инструменты Саттера	МП-285	Два миркоманипулятора необходимы для раздельного удержания ионоселективного микроэлектрода и ионтофоретического микроэлектрода. Также можно склеивать микропипетки в разнесенный массив (см. текст).
Блок преобразования сигнала с фильтром нижних частот	Аксон Инструменты	CyberAmp 320 или 380	больше не доступен у производителя, но может быть доступен на E-Bay; альтернативы: например, фильтр/усилитель FLA-01 от Cygnus Technology. Это одноканальный инструмент с минимальным срезом на частоте 10 Гц, использующий мультипольный фильтр Бесселя, но компания может захотеть модифицировать его для более низкой частоты среза (2 Гц), если это необходимо.
серебряная проволока	Системы А-М	#7830	диаметр 0,015 дюйма, голый (без покрытия)
Камера для срезов	Гарвардский аппарат	Warner Модель RC-27L	Это погружная срезная камера; не используйте интерфейсную срезную камеру
Стереомикроскоп			для силанизации и наполнения наконечника ионоселективного цилиндра жидким ионитом; горизонтально установлен; различные поставщики
хлорид тетраметиаммония (ТМА)	Сигма-Олдрич	Т-3411	5 М раствор; ВНИМАНИЕ: острая токсичность (пероральная, кожная, ингаляционная), канцерогенность, опасность для водной среды, полное описание см. в Информации о безопасности Sigma-Aldrich