Создание модели крысы с болезнью Альцгеймера с помощью инъекции бета-амилоидного пептида

Аннотация

Источник: Xiaoguang, W., et al. Создание ценной имитации болезни Альцгеймера на животной модели крысы путем внутримозгового инъекционного бета-амилоидного белка. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует процедуру инъекции бета-амилоидных пептидов, хлорида алюминия и нейровоспалительного фактора роста, которые в совокупности способствуют образованию токсичных амилоидных бляшек в области гиппокампа. Это вызывает ухудшение памяти у крысы, характерное для болезни Альцгеймера.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Хирургическая процедура

Примечание: 20 самцам крыс Спрэга-Доули были введены микроинъекции комбинированного бета-амилоидного белка (Aβ) в латеральный желудочек и антеродорсальное ядро таламуса и определены как группа, обработанная Aβ. Еще 20 крыс были подвергнуты той же операции, но получили 0,1% диметилсульфоксид (ДМСО) физиологического микроинъекции и были определены как фиктивная группа.

1. Анестезируют крыс 100% изофлураном путем ингаляции, затем ограничивают их стереотаксическим аппаратом мозга.
2. Сбрейте шерсть на макушке головы хирургическими ножницами и продезинфицируйте йодофором. Затем накройте голову одноразовым хирургическим полотенцем.
3. Сделайте разрез на коже головы вдоль срединной продольной черепицы хирургическими бисториями и ножницами.
4. Отделите подкожную клетчатку и фасцию, протрите череп черепа стерильной сухой ватой, чтобы остановить кровотечение, и отметьте брегму маркером.
5. Обратитесь к стереотаксической карте мозга крысы, рассматривая брегму в качестве точки происхождения, отметьте три точки, антеродорсальное ядро таламуса (ad) (заднее (P): 2,0 мм до брегмы; латеральное (L): 1,4 мм до средней линии) для введения рекомбинантного человеческого трансформирующего фактора роста-β1 (RHTGF-β1) и фиксации одного винта, область бокового желудочка (ЛЖ) (задняя (P): 0,8 мм до брегмы; боковой (L): 2,0 мм до средней линии) для введения бета-амилоидного белка 25-35 (Aβ25-35) и трихлорида алюминия (AlCl₃), и второго места крепления винта (Front (F): 2,0 мм до брегмы; lateral (L): 1,5 мм до средней линии).
6. Аккуратно просверлите три отверстия диаметром 1 мм гибким костным сверлом, обозначенным в трех вышеуказанных точках черепа (шаг 1,5). Не завинчивайте глубже, чем это необходимо, чтобы избежать вкалывания тканей мозга.
7. Остановите кровотечение и многократно очистите поверхность черепа стерильной сухой ватой.
8. Введите иглу, подключенную к микроинъекционному насосу, в мозг на глубину 4,6 мм и осторожно введите 1 мкл RHTGF-β1 (10 нг) в область введения. Задержите иглу в течение 2 минут после инъекции и медленно вытащите иглу.
9. Закрепите два винта в черепе, обозначенном в пунктах объявления, а второй винт в месте фиксации черепа (которое было обозначено с шагом 1,5) с помощью небольшой отвертки. Не завинчивайте глубже, чем это необходимо, чтобы избежать вкалывания тканей мозга.
10. Соберите систему имплантации канюли и вставьте фиктивную канюлю в направляющую канюлю после дезинфекции под высоким давлением.
11. С помощью держателя канюли стереотаксического аппарата крыс введите канюлю из нержавеющей стали в головной мозг на расстоянии 4,6 мм в область ЛЖ через отверстие в черепе.
12. Смешайте материал основы зубного протеза с водой основы протеза в соотношении 1,5 г на 1 мл, нанесите пасту на пластиковую опору направляющей канюли, а двумя винтами иммобилизуйте направляющую канюлю и закройте весь разрез кожи, чтобы избежать инфицирования кожи.
13. На 2-й день операции крысы были обезболены ингаляцией изофлурана с использованием аппарата для анестезии мелких животных. Вытащите фиктивную канюлю, вставьте внутреннюю канюлю в направляющую канюлю и прикрутите крепежный винт, чтобы обездвижить внутреннюю канюлю.
14. Установите полиэтиленовую трубку, которая соединяет насос микровпрыска с внутренней канюлей, и отрегулируйте скорость впрыска до 1 μл/мин. Микровпрыскивание Aβ25-35 или AlCl₃ в LV.
15. Микроинъекции 4 мкг (1 мкл) Aβ25-35 ежедневно в течение 14 дней утром и 3 мкл AlCl3 (1%) в день в течение 5 дней во второй половине дня под анестезией изофлурана.
16. Подождите 5 минут после окончания инъекции, аккуратно вытяните внутреннюю канюлю и снова вставьте пустышку в направляющую канюлю.
17. На 15-й день, после операции (что соответствует последнему дню инъекции Aβ25-35), демонтируют систему имплантации канюли. Аккуратно удалите материал основы протеза хирургическими ножницами и щипцами, открутите два винта, вытащите направляющую канюлю и продезинфицируйте рану бетадином. Заполните отверстие черепа костным цементом и зашите кожу методом простого прерывистого шва.
18. Проделайте ту же операцию с фиктивно оперируемой группой и микроинъекцией 0,1% физиологического раствора ДМСО.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Крыса Спрэг-Доули	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, Китай	SCXK(Jing) 2012-0001	300–350 г
Подвижная анестезия мелких животных	RWD Life Science Co., Ltd. Китай	Р580
Стереотаксический аппарат головного мозга	RWD Life Science Co., Ltd. Китай	68001
Гибкое костяное сверло	Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. Китай	БО-СД908
Просвечивающий электронный микроскоп	Japan Co., Ltd. Япония	ДЖЕМ-1400
Двухканальный микроинжекторный насос	RWD Life Science Co., Ltd. Китай	ЗАДНИЙ СПИД202
ЭМ микротом	Hitachi Co., Ltd. Китай	Н-7650
Муляж канюли	RWD Life Science Co., Ltd. Китай	62001	0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html
Направляющая канюля	RWD Life Science Co., Ltd. Китай	62101	0.D.0.40мм/М3.5
Внутренняя канюля	RWD Life Science Co., Ltd. Китай	62201	0.D.0.41×I.D.0.25 мм/М3.5
Затяните гайку	RWD Life Science Co., Ltd. Китай	Номер 62501	0.D.5.5мм/L7.5мм/M3.5
Крепежный винт	RWD Life Science Co., Ltd. Китай	62514	M1.2×L2.0мм(100БАО)
Шуруповерт	RWD Life Science Co., Ltd. Китай	No 62999	45 * 1 мм
Полиэтиленовые трубки	RWD Life Science Co., Ltd. Китай	62302
Бета-амилоид 25-35	Sigma Aldrich Co. США	SCP0002-5МГ
Рекомбинантный трансформирующий фактор роста человека-β1	PeproTech Inc. США	100-21
Трихлорид алюминия	Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. Китай	3011080
Цинк-фосфатный стоматологический цемент	Стоматологический материал фабрики Shanghai Medical Instruments Co., Ltd. Китай	201311