$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием животных были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Истирание подушечки лапки мыши
- Обезболите мышь C57BL/6 (в возрасте 5–7 недель) газообразным анестетиком изофлураном, который вводится в дозировке 3% через небольшую анестезиологическую систему (камеру).
- Поместите мышь в операционную плоскость анестезии на спину, перед прививкой, на заднюю подушечку лапы. Прикрепите к мыши носовой конус с диафрагмой (щель, достаточно размеренную, чтобы поместиться в морде животного) и подайте газообразный анестетик изофлуран в постоянной дозировке 1,5–2,0%.
- Внимательно следите за реакцией мыши на болезненный раздражитель, создаваемый сильным защемлением пальца ноги щипцами.
- Слегка возьмитесь за одну заднюю подушечку лапы плоскими щипцами.
- Аккуратно сотрите голую кожу задней подушечки лапы примерно в 20 раз, между пяткой и подушечками для ходьбы, наждачной доской (зернистость 100–180). Не вызывайте кровотечение, слишком часто истирая или оказывая слишком сильное давление.
- С помощью тонких щипцов медленно отклейте ороговевший в результате истирания роговой слой, чтобы обнажить базальный слой.
2. Прививка подушечек лап PRV
- Приготовьте вирусный посевной материал, разведенный до нужного титра в среде DMEM, содержащей 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин/стрептомицин (Таблица материалов).
- Количественное определение количества бляшечных единиц (PFU) в запасе вируса на клетках PK15 для расчета и стандартизации дозы вируса и соответствующего разбавления вирусного инокулюма.
заметка: В этом исследовании использовали вирулентный штамм PRV (PRVBecker) в дозе 8 x 106 PFU. Эта доза была оптимизирована в предыдущем предварительном эксперименте, чтобы гарантировать, что у всех инокулированных животных проявились клинические симптомы через 82 ч после инокуляции (ИПЦ).
- Держите вирусный инокулюм на льду и аккуратно перемешайте перед использованием.
- Добавьте каплю вирусного инокулята объемом 20 мкл (8 x 106 БОЕ) на истертую подушечку ноги (для местного применения). Параллельно проводите имитационные прививки (только в среде).
- Аккуратно разотрите 10 раз стержнем иглы, чтобы облегчить адсорбцию вируса. Избегайте царапин острием иглы. Повторяйте этот шаг каждые 10 минут.
- Держите мышь под наркозом в течение 30 минут, пока стертая подушечка лапы не высохнет.
- После прекращения анестезии наблюдайте за мышью до тех пор, пока она не сможет поддерживать лежачее положение грудины, и поместите ее в индивидуальную клетку для клинического наблюдения и забора проб.